-花青素細胞刺激素對下丘腦葡萄糖敏感神經元放電活動的影響

-花青素細胞刺激素對下丘腦葡萄糖敏感神經元放電活動的影響

i-mth是由阻斷氨基酸（popc）生產的黑皮質素家族（mh）引起的最具抑制作用的黑皮質素家族的成員。在已知的5種黑皮質素受體中只有MC3R和MC4R分布于腦內,α-MSH是其內源性配體,介導生理性飽感信號,從而在調控體質量和能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。研究表明,在第四腦室或迷走神經背核注射MC3R/4R激動劑MTII或拮抗劑SHU9119分別產生抑制和促進攝食的效應。下丘腦室旁核(PVN)和下丘腦外側區(qū)(LHA)接受大量由弓狀核(ARC)POMC/CART神經元發(fā)出的傳入信號,經過整合后進一步作用于下游的孤束核(NTS)。而NTS內的POMC神經元在參與迷走-迷走反射的同時,進一步將外周來的信號整合投射到下丘腦的PVN等核團。我們先前已觀察到α-MSH對腦干背側迷走復合體(DVC)的葡萄糖敏感神經元和胃擴張敏感神經元的放電活動具有調制作用,但是α-MSH對下丘腦葡萄糖敏感神經元的作用仍不清楚。大量的研究結果已證明,LHA主要含有葡萄糖抑制型(GI)神經元,VMH主要含有葡萄糖興奮型(GE)神經元,而PVN中含有GI和GE兩類神經元。本實驗旨在通過觀察α-MSH對下丘腦葡萄糖敏感神經元放電活動影響,從而進一步探討α-MSH在下丘腦參與攝食調控的可能機制。1材料和方法1.1飼養(yǎng)管理健康Wistar大鼠150只,雌雄各半,體質量250～300g,由青島市藥品檢驗所提供。依據青島大學動物飼養(yǎng)道德規(guī)范飼養(yǎng),室溫20～25℃,12-12h晝夜循環(huán)光照條件下,自由攝食和飲水,預養(yǎng)1周。實驗藥品α-MSH、SHU9119及葡萄糖D-(+)-Glucose均系Sigma公司產品,其使用濃度分別為500nmol/L、1mol/L和0.5mol/L,pH7.4,以上藥品均以9g/L的NaCl溶液配制。1.2立體定位儀烏拉坦(1.0g/kg)腹腔麻醉大鼠,手術中酌情追加水合氯醛。維持體溫(37±1)℃。將大鼠置于立體定位儀上,門齒條低于耳桿中心3.4mm。剪去大腦上方皮膚,用牙科鉆去除顱骨,清除腦膜,以加熱的30～40g/L瓊脂生理鹽水溶液覆蓋在大腦表面,并保持前后囟水平。1.3壓力注射檢測paxilus-w龍制備四管玻璃微電極,尖端直徑約3～10μm,電極阻抗5～20MΩ,用于電生理記錄和微量注射。記錄電極充灌0.5mol/L的醋酸鈉和2g/L滂胺天藍(pH7.7)。另外3管分別充灌α-MSH、葡萄糖及生理鹽水或SHU9119,分別與壓力注射儀的管道相連。按照Paxinos-Watson圖譜定位。LHA:前囟后(AP)1.8～2.3mm,旁開(L/R)1.5～2.0mm,深度(D)7.5～9.0mm。PVN:AP為1.8～2.3mm,L/R為0.1～0.4mm,D為7.7～8.4mm。VMH:AP為2.8～3.3mm,L/R為0.2～1.0mm,D為9.3～10.0mm。1.4葡萄糖敏感神經元放電頻率的測定通過監(jiān)聽器聲音變化和監(jiān)視器顯示基線漂移突然變細的現象來判斷電極尖端到達空氣與瓊脂界面,用液壓推進操縱器將微電極下至接近預定深度尋找神經元,經4-導壓力注射儀(PM2000B,MicroDataInstrument,Inc.USA)將藥物注射到神經元表面。記錄放電神經元穩(wěn)定放電至少150s后,加壓注射葡萄糖(GS),觀察其放電頻率的變化,注射前后放電頻率改變在20%以上者記為葡萄糖敏感神經元。待放電頻率恢復穩(wěn)定至少150s后,再微量注射α-MSH觀察3～6min,待放電頻率再次恢復并穩(wěn)定至少150s后注入生理鹽水作為對照?；蛘叽烹娀謴筒⒎€(wěn)定150s后注入SHU9119,然后于20s內注入α-MSH對比觀察其放電頻率的變化。放電信號經MEZ-8201型微電極放大器輸入VC-11雙道示波器的上線顯示波形,電信號經由示波器同步Y軸輸出,通過SUMP-PC生物信號處理系統(tǒng)輸入計算機,由Histo軟件進行放電頻率分析。1.5大鼠腦注射法記錄完畢,通過玻璃微電極電泳,滂胺天藍標記最后一個記錄位點(-20μA,15min)。大鼠在過量麻醉下,經心臟灌注生理鹽水100mL,隨后用40g/L多聚甲醛溶液150mL灌注固定;取腦后固定4h;冠狀冷凍切片(厚度100μm),確定記錄神經元的位置。1.6神經元棄之用量對符合鑒定標準的神經元進行分析,非葡萄糖敏感或者記錄位置在3個核團之外的神經元棄之不用。用MATLAB7.0和SPSS16.0軟件統(tǒng)計,實驗數據以xˉ±sxˉ±s表示。加藥前后頻率變化比較采用成對t檢驗,放電頻率變化百分比之間的比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有顯著性。2結果2.1gs對火炬放空頻率的影響在LHA記錄到的78個神經元中有26個(33.33%)GE神經元,36個(46.15%)GI神經元。36個GI神經元中有75%(27個)被α-MSH所抑制。而26個GE神經元中被α-MSH所興奮和抑制的神經元數目相等,均為8個。對于被α-MSH抑制的27個GI神經元,在加入GS前后放電頻率分別為(5.61±0.87)和(2.62±0.55)Hz,加入GS前后放電頻率比較差異有極顯著意義(t=6.79,P<0.01),平均降低了56.16%±3.84%;而在加入α-MSH前后其放電頻率分別為(3.72±0.49)和(1.39±0.29)Hz,加入α-MSH前后其放電頻率比較差異有顯著性(t=6.08,P<0.01),平均降低了59.99%±4.51%。其中12個被α-MSH抑制的GI神經元,先后加入SHU9119和α-MSH,神經元的放電頻率變化百分比由(52.90±1.53)%降低到(20.88±0.60)%(t=3.38,P<0.01),表明α-MSH對GI神經元的抑制效應部分被阻斷。2.2-msh前后放電頻率的變化在PVN共記錄到68個神經元,其中有27個(39.71%)GE神經元,其中24個被α-MSH興奮;有20個(29.41%)GI神經元,其中14個被α-MSH抑制。其中被α-MSH興奮的24個GE神經元,在加入GS前后的放電頻率分別為(3.20±0.75)和(5.99±1.03)Hz,加入GS前后的放電頻率比較差異有顯著意義(t=6.88,P<0.01),平均升高了128.64%±18.87%;在加入α-MSH前后放電頻率分別為(2.06±0.22)和(5.00±0.54)Hz,加入α-MSH前后放電頻率比較差異有顯著性(t=7.05,P<0.01),平均升高了(156.53±19.65)%。被α-MSH抑制的14個GI神經元,加入GS前后的放電頻率分別為(1.74±0.31)和(0.61±0.16)Hz,加入GS前后的放電頻率比較差異有顯著性(t=6.71,P<0.01),平均降低了(67.86±3.73)%;給予α-MSH前后放電頻率分別為(1.43±0.17)和(0.28±0.07)Hz,給予α-MSH前后放電頻率比較差異有顯著性(t=8.46,P<0.01),平均降低了(77.79±4.08)%。對7個被α-MSH抑制的GI神經元先后加入SHU9119及α-MSH,放電頻率變化百分比由(152.32±37.46)%降低到(27.09±7.56)%(t=3.27,P<0.01)。對18個被α-MSH興奮的GE神經元同樣預先給予SHU9119,其放電頻率變化百分比由(143.48±22.06)%降低到(39.84±6.28)%(t=4.52,P<0.01),結果表明α-MSH的效應部分被阻斷。2.3gs前后e神經元放電頻率的變化在VMH共記錄到的56個神經元中GE神經元有22個(39.29%),GI神經元有8個(14.29%)。22個GE神經元中被α-MSH所興奮的神經元有20個(90.91%)。被α-MSH所興奮的20個GE神經元,加入GS前后其放電頻率分別為(1.68±0.22)和(4.12±0.51)Hz,加入GS前后其放電頻率比較差異有顯著意義(t=6.44,P<0.01),平均升高了(167.42±20.66)%;而在加入α-MSH前后其放電頻率分別為(1.59±0.19)和(3.93±0.32)Hz(t=9.24,P<0.01),平均升高了(181.91±32.52)%。其中有10個被α-MSH所興奮的GE神經元預先給予SHU9119,其放電頻率變化百分比由(186.20±50.36)%降低到了(24.31±5.89)%(t=3.19,P<0.05),表明α-MSH對GE神經元的興奮效應部分被阻斷。3mc4r基因缺陷對人類實驗者的作用中樞POMC系統(tǒng)調節(jié)能量平衡是通過黑質素受體(MC4R/3R)的內源性激動劑α-MSH及其內源性的拮抗劑AgRP的作用來實現的。POMC的過度表達會伴隨MC4R/3R以及α-MSH的表達增加,從而導致饑餓感增強,這些效應都能夠通過預先給予SHU9119而得到抑制。有研究結果表明,用α-MSH免疫后大鼠與正常組對比在限制攝食和繼續(xù)腹腔給予α-MSH后,其攝食量有明顯增加。預先腦室注射SHU9119,下丘腦促進攝食的臨界點就會上調。POMC神經元僅在ARC和NTS兩核內分布,而這兩個部位又是通過與下丘腦的LHA、PVN、VMH等核團的纖維聯系進行整合作用。本實驗結果顯示,在LHA內主要是GI神經元且大部分被α-MSH所抑制,在VMH內則主要為GE神經元且絕大部分被α-MSH所興奮,而在加入MC4R拮抗劑SHU9119后,α-MSH的作用則大部分被阻斷。我們傳統(tǒng)認為LHA為饑餓中樞,VMH為飽食中樞,α-MSH通過抑制饑餓中樞同時興奮飽食中樞從得達到抑制攝食的效應。人們普遍認為PVN在控制食欲以及能量平衡方面發(fā)揮著至關重要的作用,對促進和抑制食欲的信號的處理起到一個中轉站的作用。本實驗PVN內有88.89%的GE神經元被α-MSH所興奮,70%的GI神經元被α-MSH所抑制,同時給予SHU9119后α-MSH的作用部分被阻斷,說明了在PVN內這兩類神經元的興奮性可以被α-MSH所調制。本文結果也進一步證明了PVN在