免疫學(xué)終結(jié)版

免疫學(xué)在食品分析中的應(yīng)用基礎(chǔ)知識(shí)免疫學(xué)：研究自身防御，機(jī)體如何識(shí)別異物并與之發(fā)生反應(yīng)的一門科學(xué)，它在生長(zhǎng)、遺傳、衰老、腫瘤、移植以及自身免疫病的發(fā)生上都有重要的作用。

免疫（Immunity）：指生物機(jī)體識(shí)別自身和非自身物質(zhì)，對(duì)自身物質(zhì)形成天然免疫耐受，對(duì)非自身物質(zhì)產(chǎn)生清除作用的一種生理學(xué)反應(yīng)。近年來,國(guó)內(nèi)外許多專家學(xué)者致力于食品檢驗(yàn)方法的研究,出現(xiàn)了許多快速檢驗(yàn)新技術(shù),如免疫技術(shù)包括:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、放射免疫測(cè)定、免疫傳感器、阻抗測(cè)量法、生物發(fā)光法與化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫測(cè)定、金黃色葡萄球菌A蛋白及其協(xié)同凝集試驗(yàn),核酸探針、磁性分離技術(shù)等。4主要內(nèi)容3：

免疫熒光技術(shù)1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)2放射免疫技術(shù)(RIA)3單克隆抗體技術(shù)4一.免疫熒光技術(shù)（一）基本原理：抗體與熒光素結(jié)合后，并不影響其和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，事先將待測(cè)抗原固定于載玻片上，滴加熒光標(biāo)記抗體，若熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，不能被緩沖液沖掉，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光，否則熒光抗體被緩沖液沖掉，在熒光顯微鏡下觀察不到熒光。（二）抗體的熒光標(biāo)記：熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機(jī)化合物,也稱熒光色素。目前用于標(biāo)記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。標(biāo)記原理:利用抗體蛋白的自由氨基與FITC的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。

異硫氰酸熒光素(FITC)熒光素與抗體結(jié)合方法：

⑴透析法：①適用于蛋白質(zhì)含量低、樣品體積小的抗體溶液的標(biāo)記

②標(biāo)記較均勻，非特異熒光較低

⑵攪拌法：①適用于蛋白質(zhì)含量較高、樣品體積較大的抗體溶液的標(biāo)記

②標(biāo)記時(shí)間短、效率較高，熒光素用量節(jié)省

③影響因素多，非特異熒光較強(qiáng)（三）標(biāo)本的制作：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中，熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)標(biāo)本的制作方法是將樣品增菌液涂在載玻片上，涂片應(yīng)薄而均勻，干燥后用化學(xué)方法固定，然后進(jìn)行熒光染色。直接法直接熒光抗體染色法示意圖熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。（四）熒光抗體染色方法間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。

間接熒光抗體染色法示圖抗原抗體標(biāo)記抗體光原熒光補(bǔ)體結(jié)合法

兩種熒光素分別標(biāo)記的兩種不同的特異性抗體，與同一標(biāo)本反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察兩種顏色熒光。抗體補(bǔ)體標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體光源熒光（五）在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，可檢測(cè)細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，在食品衛(wèi)生領(lǐng)域也應(yīng)用得越來越多。二.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)?；驹恚核捎每乖c抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定，測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）

測(cè)量時(shí)，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。

其所生成的顏色深淺與欲測(cè)的抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(jì)（酶標(biāo)儀）加以測(cè)定。

其方法簡(jiǎn)單，方便訊速，特異性強(qiáng)。

間接法雙抗體夾心法捕獲法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA常用的操作方法間接法方法

用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗體IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)

一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。ELISA檢測(cè)抗體的方法1、已知抗原吸3、加酶標(biāo)抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗體吸2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色。應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測(cè)抗體的方法競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測(cè)。ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法原理：抗人IgMμ鏈抗體包被，捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體。加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體，底物顯色。應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體，甲型肝炎HAV-IgM抗體，乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體。ELISA檢測(cè)抗體的方法ELISA法在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用1.動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)近年來動(dòng)物性食品藥物殘留問題更加突出。食品中獸藥殘留主要包括抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲類、激素藥類和驅(qū)蟲藥類藥物。目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)藥物殘留研究取得較大進(jìn)展。瘦肉精是現(xiàn)在肉制品中的一種常見的添加劑,可致癌變或直接影響人體健康,是一種β2-腎上激素受體激動(dòng)劑,化學(xué)名為鹽酸克倫特羅。ELISA法應(yīng)用于瘦肉精檢測(cè)靈敏度高,成本低,前處理簡(jiǎn)單且快速。2.食品中農(nóng)藥殘留的測(cè)定農(nóng)藥殘留是指農(nóng)藥使用后殘存于食品(農(nóng)副產(chǎn)品)中的微量農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱。目前，農(nóng)殘已成為我國(guó)人民膳食的主要食品安全問題，也是影響我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口的一個(gè)重要因素?？捎肊LISA檢測(cè)的農(nóng)藥殘留種類包括:1.有機(jī)磷農(nóng)藥2.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥3.有機(jī)氯類農(nóng)藥。3.食品中生物毒素的檢測(cè)生物毒素是其產(chǎn)生菌在適合產(chǎn)毒的條件下所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。在食品加工時(shí)雖然經(jīng)加熱、烹調(diào)等熱處理,但所產(chǎn)生的毒素結(jié)構(gòu)一般不能被破壞,所以食品中生物毒素也日益受到關(guān)注。黃曲霉毒素是一種致毒性和致癌性很強(qiáng)的真菌毒素,各國(guó)都嚴(yán)格限制其在食品中的含量。1977年,LaWell首次采用了ELISA法來檢測(cè)黃曲霉毒素，建立了直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)黃曲霉毒素B1。隨后,美國(guó)學(xué)者朱繁生教授、英國(guó)學(xué)者M(jìn)orge教授改進(jìn)了直接法并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。4.食品中病原微生物的檢測(cè)食品安全問題中,首要問題是微生物污染。檢測(cè)微生物的方法很多,常規(guī)的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法試劑繁雜、檢驗(yàn)周期長(zhǎng),遠(yuǎn)不能適應(yīng)實(shí)際需要,而ELISA法很好的彌補(bǔ)了這一缺陷,用ELISA法可檢測(cè)食品中沙門氏菌、大腸桿菌等微生物,其中通過制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的ELISA技術(shù)研究最多,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。5.轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的安全性是最近有關(guān)食品安全性研討的熱點(diǎn)。由于其安全性還在爭(zhēng)議之中,許多國(guó)家都有嚴(yán)格的法規(guī)來管理轉(zhuǎn)基因食品。這就需要對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測(cè)。ELISA法就是通過檢測(cè)某些特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分,或間接檢測(cè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的目的蛋白質(zhì)。ELISA試劑盒三.放射免疫技術(shù)(RIA)基本原理：

應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記待測(cè)物，形成標(biāo)記抗原。以一定量的標(biāo)記抗原，與各種不同量的非標(biāo)記待測(cè)物和一定濃度的特異性抗待測(cè)物抗體相互作用，其反應(yīng)遵照質(zhì)量作用定律，標(biāo)記待測(cè)物與非標(biāo)記待測(cè)物競(jìng)爭(zhēng)抗待測(cè)物抗體的結(jié)合部位，產(chǎn)生不同的結(jié)合率。當(dāng)標(biāo)記的待測(cè)物與抗待測(cè)物抗體的量保持一定時(shí)，則標(biāo)記的待測(cè)物與抗待測(cè)物抗體形成的復(fù)合物的多少就反映了待檢物的含量。放射性同位素標(biāo)記的抗原高質(zhì)量的特異性抗體高純度的標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液放射免疫分析的必備條件Diagram固相放射免疫測(cè)定1.抗體的包被2.抗原抗體反應(yīng)。3.B、F分離。4.放射性強(qiáng)度的測(cè)定。液相放射免疫測(cè)定1.抗原抗體反應(yīng)2.B、F分離技術(shù)3.放射性強(qiáng)度的測(cè)定。放射免疫測(cè)定法放射免疫技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用放射免疫法分析由于靈敏度高，特異性強(qiáng)，精密度高，特別適應(yīng)于蛋白質(zhì)、激素和多肽的精確定量測(cè)定。放射免疫技術(shù)由于可以避免假陽性，適宜于陽性率較低的大量樣品檢測(cè)，對(duì)水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、果疏產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。還可檢測(cè)經(jīng)食品傳播的細(xì)菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生蟲及小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)用放射免疫測(cè)定牛奶中的天花粉蛋白。四.單克隆抗體基本原理：?jiǎn)慰寺】贵w技術(shù)是應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性,它既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性,用這種來源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群,可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。單克隆抗體制備的簡(jiǎn)易過程過程B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞（B-瘤細(xì)胞）克隆化培養(yǎng)抗體檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體單克隆抗體在食品檢測(cè)中的應(yīng)用單克隆抗體在食品檢測(cè)中最大的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，不易出現(xiàn)假陽性。在食品檢測(cè)中有廣泛的應(yīng)用前景。目前人們已制備出各種經(jīng)食品傳播和引起食物中毒的細(xì)菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生蟲、農(nóng)藥、獸藥、激素等的單克隆抗體并建立的檢測(cè)方法?；前范奏奏ず涂藗愄亓_(瘦肉精)這兩種藥物被歐美各國(guó)和我國(guó)列為獸藥殘留控制重點(diǎn)，國(guó)內(nèi)研究出了用于動(dòng)物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測(cè)的單克隆抗體試劑盒和克倫特羅殘留檢測(cè)的多克隆試劑盒。單克隆抗體技術(shù)可對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥和激素殘留快速檢測(cè)，在10min中內(nèi)快速檢測(cè)有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、有機(jī)氯類及激素類的殘留量。參考文獻(xiàn)[1]任亞妮,車振明.免疫標(biāo)記技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品,2010,03:34-36.[2]韓婷,陳紅兵.免疫分析技術(shù)在食品農(nóng)殘藥殘檢測(cè)方面的應(yīng)用[J].江西食品工業(yè),2008,03:32-34.[3]李軍生,葉云,梁超香,何仁.免疫檢測(cè)技術(shù)在食品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].廣西工學(xué)院學(xué)報(bào),2005,01:23-26.[4]洪葵.免疫學(xué)技術(shù)及其在食品中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),1996,12:3-6.[5]郎需龍,劉文森,王興龍.免疫學(xué)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].肉類工業(yè),2009,05:33-35.[6]肖韡,買娜,王旭峰,常錚.酶聯(lián)免疫吸附法在植物性食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2006,12:920-923.[7]馬頎,任珊,許美玉.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品科技,2008,01:200-204.[8]彩鴻翔,魯曉翠,侯玉澤,李卓洋,劉宣兵.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,06:67-69.[9]邱偉芬.酶聯(lián)免疫吸附分析及其在食品安全