棉花立枯絲核菌rhizoconiasolai的解磷和解鉀能力

棉花立枯絲核菌rhizoconiasolai的解磷和解鉀能力

木霉（tichoudma授粉）可以通過多種機(jī)制抑制植物病原體，為預(yù)防和控制疾病帶來疾病，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)植物抗病。這是預(yù)防和處理重要植物病害的重要機(jī)制。除了生防功能之外,已有研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉、哈茨木霉等可以溶解難溶性無機(jī)磷酸鹽以及金屬礦物,為植物生長(zhǎng)提供有效的磷素和礦物營(yíng)養(yǎng);也有關(guān)于木霉植酸酶活性的報(bào)道。本研究對(duì)從土壤中分離獲得的木霉菌株進(jìn)行多功能評(píng)價(jià),包括拮抗、解磷、解鉀、固氮及植酸酶活性等,然后對(duì)多功能木霉進(jìn)行種類鑒定,為挖掘高效植病生防木霉資源提供依據(jù)。1材料和方法1.1土壤樣品的采集土樣采自山東聊城、壽光、臨沂、章丘等4市有代表性的地點(diǎn)(西紅柿大棚、黃瓜大棚、白菜種植區(qū)、韭菜種植區(qū)、大蒜種植區(qū)、蔥種植區(qū)等),共采集土壤樣品120份。木霉的分離采用稀釋平板法,參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。為防止木霉菌落過度擴(kuò)張影響分離效果以及后續(xù)水解圈、抑菌圈的觀察,除固氮能力測(cè)定外,其余實(shí)驗(yàn)均在固體培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為0.05%的TritionX-100,以限制菌落的擴(kuò)展速度。1.2抗菌材料檢測(cè)將待測(cè)木霉菌與立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)同步活化后,同時(shí)接種于PDA平板上對(duì)峙培養(yǎng),平板直徑為90mm,兩個(gè)菌接種距離為50mm,72h后觀察拮抗情況。1.3酶活劑的制備培養(yǎng)基:葡萄糖10.0g;(NH4)2SO40.5g,NaCl0.3g,KCl0.3g,MgSO4·7H2O0.3g,FeSO4·7H2O0.03g,MnSO4·4H2O0.03g,NaH2PO46.2g,瓊脂18.0g,蒸餾水補(bǔ)足至1L,pH7.0～7.5,115℃30min滅菌備用。另配制50%CaCl2溶液,滅菌備用。用前每100mL培養(yǎng)基中加入2.0mL50%的CaCl2溶液,搖勻,倒平板使用。接菌后觀察透明水解圈判定解無機(jī)磷能力。磷釩鉬黃比色法測(cè)定液體培養(yǎng)基中的可溶性磷含量,計(jì)為(PO4)3-含量(μg/mL)。1.4u3000酸、堿、堿分別滴定聚合劑.培養(yǎng)基:葡萄糖5.0g,MgSO4·7H2O0.5g,FeCl30.005g,Na2HPO42.0g,CaCO30.1g,鉀長(zhǎng)石1.0g;蒸餾水定容至1L,pH值為7.0～7.4。四苯硼鈉滴定法測(cè)定液體培養(yǎng)基中的可溶性鉀含量,以KCl含量(μg/mL)計(jì)。1.5caso3.2g添加caso3.2o,caso3.2o法培養(yǎng)基:KH2PO40.2g,CaCO35.0g,MgSO4·7H2O0.2g,NaCl0.3g,甘露醇10.0g,CaSO4·2H2O0.1g,瓊脂18g,蒸餾水定容至1L,pH=7.0。接菌后根據(jù)生長(zhǎng)情況判斷是否具有固氮能力。1.6分配規(guī)則培養(yǎng)基:植酸鈣10.0g,葡萄糖20.0g,NH4NO35.0g,KCl0.5g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.1g,MnSO4·H2O0.01g,瓊脂20.0g。接菌后通過觀察水解圈的有無,判定植酸酶活性。1.7木霉it1-5.8s-sa2段序列的擴(kuò)增、測(cè)序及菌株種類檢測(cè)采用形態(tài)學(xué)結(jié)合ITS序列測(cè)定比對(duì)法鑒定木霉的種類,利用通用引物ITS4、ITS5擴(kuò)增木霉ITS1-5.8S-ITS2段序列,產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序,所得序列信息通過TrichoKEY軟件進(jìn)行序列比對(duì),鑒定菌株種類。2結(jié)果與分析2.1重復(fù)寄生蟲及產(chǎn)生抑菌圈通過對(duì)120份來自不同地區(qū)不同作物的土壤樣品進(jìn)行木霉分離,共獲得244株木霉菌。通過對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),244株木霉均顯示出對(duì)棉花立枯絲核菌拮抗作用,表現(xiàn)為重復(fù)寄生以及產(chǎn)生抑菌圈,其中114株的抑菌圈明顯可見。按照抑菌圈大小,結(jié)合重復(fù)寄生能力觀察,選擇其中的19個(gè)綜合拮抗能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行種類的分子鑒定、液體條件下解磷和解鉀能力測(cè)定,這19個(gè)菌株為T8-4、T9-1、T13-8、T17、T18-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T34、T35-1、T38-5、T38-6、T44-1、T47-4、T57、T61-2、T62-2和T80-2。2.2木霉中的解磷圈在解磷培養(yǎng)基上,上述具有明顯抑菌作用的114株木霉中,有74株產(chǎn)生明顯的解磷圈,所有114個(gè)菌株在固氮培養(yǎng)基上無明顯生長(zhǎng)現(xiàn)象,因此推斷這些菌株都不能固氮。2.3植物酸酶活性測(cè)定在平板上檢測(cè)了上述114個(gè)菌株的植酸酶活性,發(fā)現(xiàn)所有菌株都能水解植酸鈣,表明具有植酸酶活性,多數(shù)菌株的水解圈都超出了菌落覆蓋范圍。2.4-菌株磷值的測(cè)定菌液中可溶性磷、鉀含量測(cè)定結(jié)果見表1?？梢钥闯?19個(gè)木霉菌株在液體培養(yǎng)條件下對(duì)Ca3(PO4)2具有不同的降解能力,菌株T13-8、T23釋放出的可溶性磷明顯高于其他菌株,以(PO4)3-形式計(jì),分別為1.792μg/mL、1.652μg/mL,菌液的pH值也明顯降低,由起始pH=7.5分別降到pH=5.60和pH=5.79,表示解磷作用與pH值有一定關(guān)系。在液體培養(yǎng)條件下,有8個(gè)木霉菌株檢測(cè)到了解鉀活性,其中菌株T47-4的解鉀能力明顯高于其他菌株,釋放培養(yǎng)基中的可溶性鉀含量達(dá)20.585μg/mL(以KCl計(jì)),與報(bào)道過的細(xì)菌解鉀能力(15.61μg/mL～55.9μg/mL)相當(dāng)。2.5trc下3個(gè)菌株的trianum檢測(cè)經(jīng)過形態(tài)學(xué)和ITS序列比對(duì)鑒定,19株木霉屬于4個(gè)不同的木霉種類,其中菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1等9個(gè)菌株為Trichodermalongibrachiatum;菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17等8個(gè)菌株為T.harzianum;菌株T61-2和菌株T18-1分別為T.virens和T.citrinoviride。3討論和結(jié)論(1)可溶性磷的處理Anusuya等發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)條件下,T.harzianum,T.pseudokoningii和T.viride可降解磷酸鈣釋放出可溶性磷,培養(yǎng)液的pH值最終表現(xiàn)為降低。Rudresh等在研究木霉菌T.viride、T.virens、T.harzianum在液體培養(yǎng)條件下溶解難溶性磷酸鹽時(shí),也發(fā)現(xiàn)了同樣結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)木霉在固體和液體培養(yǎng)條件下具有解磷作用,故推斷,解磷能力在木霉中是普遍存在的。在液體培養(yǎng)條件下,一些在固體基上有解磷圈的菌株并未檢測(cè)到解磷活性,表明木霉的解磷活性與培養(yǎng)條件可能有密切關(guān)系。(2)木霉菌的酶活性1999年,Nasi等研究發(fā)現(xiàn)T.reesei同時(shí)具有植酸酶及酸性磷酸酶活性。本研究發(fā)現(xiàn)所有測(cè)定的114個(gè)木霉菌株都表現(xiàn)出植酸酶活性。植酸是土壤中磷被固定的一種形式,木霉由于產(chǎn)生植酸酶,能夠釋放被植酸所固定的磷素營(yíng)養(yǎng),供給植物吸收利用。(3)解鉀能力的木霉菌目前報(bào)道的解鉀微生物多為硅酸鹽細(xì)菌,具有解磷能力的真菌報(bào)道相對(duì)較少,具有解鉀能力的木霉菌的報(bào)道則幾乎沒有。本實(shí)驗(yàn)通過液體培養(yǎng)后檢測(cè),發(fā)現(xiàn)某些木霉菌株確實(shí)能夠從鉀長(zhǎng)石中釋放出可溶性鉀,特別是菌株T47-4的解鉀能力與已報(bào)道的解鉀細(xì)菌能力相當(dāng)。(4)木霉菌株鑒定在相關(guān)文獻(xiàn)中至今沒有發(fā)現(xiàn)具有固氮能力的木霉菌株。本研究所測(cè)試的所有木霉菌株,在無氮固體培養(yǎng)基上都不能生長(zhǎng),表明沒有固氮能力,因而沒有做進(jìn)一步的固氮驗(yàn)證研究。(5)形態(tài)鑒定與生物學(xué)鑒定本研究所分離的木霉,都采集自山東省傳統(tǒng)的蔬菜生產(chǎn)基地。通過形態(tài)鑒定與分子生物學(xué)鑒定,表明19個(gè)菌株屬于4個(gè)木霉種類,其中17個(gè)菌株為長(zhǎng)枝木霉或哈茨木霉,這兩個(gè)種類應(yīng)是山東省蔬菜田的優(yōu)勢(shì)種類。(6)木霉對(duì)黃瓜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用作為植病生防菌,木霉是最重要的成員之一,也是迄今商品化次數(shù)最多的。木霉的抗菌特性是作為生防菌的首要條件,但考慮到商業(yè)化應(yīng)用,也應(yīng)當(dāng)考慮到其他功能,例如肥料功能,或者刺激植物生長(zhǎng)的能力。在這些方面,已經(jīng)有人注意,例如1999年,Altomare等發(fā)現(xiàn),T.harzianum菌株T22具有溶解可溶性或微溶性礦物質(zhì)的能力,通過螯合或降解作用來溶解金屬氧化物,促進(jìn)植物對(duì)礦物質(zhì)的吸收,提高植物的生長(zhǎng)量;2001年,Yedidia等發(fā)現(xiàn)木霉菌促進(jìn)