生物制藥工藝學試題及答案

生物制藥工藝學名詞解釋第一章：1.藥品：一定劑型和規(guī)格的藥物并賦予一定的形式（如包裝），而且經(jīng)過有關(guān)部門的批準，有明確的作用用途。藥物：能影響機體生理、生化和病理過程，用以預防、診斷、治療疾病和計劃生育的化學物質(zhì)。2.生物藥物Biopharmaceuticals：以生物體、生物組織或其成份為原料綜合應(yīng)用生物學、物理化學與現(xiàn)代藥學的原理與方法加工制成的藥物。3.生物活性Biologicalactivity,Bioactivity：對活組織如疫苗有影響的特性。4.酶工程enzymeengineering：酶學與工程學互相滲透結(jié)合，發(fā)展形成的生物技術(shù)，它是從應(yīng)用目的出發(fā)，研究酶和應(yīng)用酶的特異催化功能，并通過工程化過程將相應(yīng)原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物的技術(shù)。5.固定化酶immobilizedenzyme：是指借助于物理和化學的方法把酶束縛在一定空間內(nèi)并具有催化活性的酶制劑。6.組合生物合成combinatorialbiosynthesis（組合生物學combinatorialbiology）：應(yīng)用基因重組技術(shù)重新組合微生物藥物的基因簇，產(chǎn)生一些非天然的化合物。7.藥物基因組學：一門研究個人的基因遺傳如何影響身體對藥物反應(yīng)的科學。8.凝聚作用coagulation：指在電解質(zhì)作用下，膠粒粒子的擴散雙電子層排斥電位降低，破壞了膠體系統(tǒng)的分散狀態(tài)，使膠體粒子發(fā)生聚集的過程。9.萃取extraction：將物質(zhì)從基質(zhì)中分離出來的過程。一般指有機溶劑將物質(zhì)從水相轉(zhuǎn)移到有機相的過程。10.反萃取stripping/backextraction：將萃取液與反萃取劑相接觸，使某種被萃入有機相的溶質(zhì)轉(zhuǎn)入水相的過程。11.萃取因素/萃取比：萃取溶質(zhì)進入萃取相的總量與該溶質(zhì)在萃余相中總量之比。12.分離因素separationfactor：在同一萃取體系內(nèi)兩種溶質(zhì)在同樣條件下分配系數(shù)的比值。13.雙相萃取技術(shù)two-aqueousphaseextraction：利用不同的高分子溶液相互混合可產(chǎn)兩相或多相系統(tǒng)，靜置平衡后，分成互不相溶的兩個水相，利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來進行萃取的方法。14.超臨界流體萃取技術(shù)：利用處于臨界壓力和臨界溫度以上的一些溶劑流體所具有特異增加物質(zhì)溶解能力來進行分離純化的技術(shù)。15.固相析出分離法solidphasecrystallization：通過改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)。16.鹽析法saltprecipitation：利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。17.有機溶劑沉淀法organicsolventprecipitation：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。18.等電點沉淀法：利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低而各種蛋白質(zhì)又具有不同等電點的特點進行分離的方法。19.結(jié)晶crystallization：溶液中的溶質(zhì)在一定條件下因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體。20.吸附adsorption：物質(zhì)從流動相（氣體或液體）濃縮到固體表面從而達到分離的過程。21.凝膠層析gelchromatography：將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離的層析方法。22.離子交換法：利用溶液中帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行23.色譜聚焦chromatofocusing：是一種高分辨的新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點，結(jié)合離子交換技術(shù)的大容量色譜。24.多緩沖劑：一種兩性電解質(zhì)緩沖劑，是分子量大小不同的多種組分的多羧基多氨基化合物。25.親和純化技術(shù)affinitypurification：利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)。26.親和層析affinitychromatography：利用生物大分子具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的分離純化技術(shù)。27.配基ligand：在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。28.載體matrix：與配基結(jié)合的層析介質(zhì)。29.親和過濾affinityfiltration：將親和層析和膜過濾技術(shù)結(jié)合運用，包括親和錯流過濾和親和膜分離。30.親和錯流過濾affinitycrossflowfiltrationACFF：將親和層析與超濾技術(shù)結(jié)合，高分子底物經(jīng)專一可逆的親和反應(yīng)后，用膜進行錯流過濾，兼有親和層析與膜過濾的優(yōu)點。31.親和膜affinitymembrane：利用親和配基修飾的微濾膜為親和吸附介質(zhì)親和純化目標蛋白質(zhì)，是固定床親和層析的變型。32.親和萃取affinityextraction/親和分配：affinitypartitioning：利用偶聯(lián)親和配基PEG為成相聚合物進行的雙水相萃取。33.親和反膠團萃取affinity-basedreversedmicellarextraction：指在反膠團相中除通常的表面活性劑以外，添加另一種親水頭部為親和配基的助表面活性劑，通過親和配基與目標分子的親和結(jié)合作用，促進目標產(chǎn)物在反膠團相的分配。34.親和沉淀affinityprecipitation：生物親和相互作用與沉淀分離相結(jié)合的生物大分子的分離純化技術(shù)。35.親和電泳affinityelectrophoresis：將電泳與親和層析相結(jié)合新發(fā)盛的一種新型制備規(guī)模的生物分離技術(shù)。36.離心技術(shù)centrifugation：利用離心力分離復雜混合物組分的方法，37.離心力centrifugationforce：在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到向外的力。38.相對離心力relativecentrifugationforceRCF：實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。39.沉降速度：在離心力作用下，物質(zhì)粒子于單位時間沿離心力方向移動的距離。40.沉降系數(shù)：在單位離心力場中，顆粒的沉降速度。41.膜分離技術(shù)membraneseparationtechnology：利用天然或人工合成的、具有選擇透過性的薄膜，以外界能量或化學位差為推動力，對雙組分或多組分體系進行分離、分級、提純或富集的過程。42.超濾技術(shù)ultrafiltrationtechnology：分子級膜分離手段，以壓力差為推動力將不同分子量的物質(zhì)進行選擇性分離。43.塔板理論theplatemodel：闡明了色譜、蒸餾和萃取之間的相似性，將色譜柱設(shè)想成由許多液液萃取單元或理論塔板組成。44.速率理論：研究各種動力學因素對峰展寬的影響。45.純化purification：根據(jù)目的蛋白與雜質(zhì)之間的差異進行純化。46.反義核酸：指天然存在或人工合成的，能與靶DNA或RNA堿基互補，并能與之結(jié)合特異阻斷其翻譯的一段DNA或RNA。47.黏多糖：指含有氨基糖與糖醛酸或它的衍生物的多糖。48.抗生素：由生物在其生命過程中所產(chǎn)生的一類在微量濃度下就能選擇性地抑制它種生物或細胞生長地次級代謝產(chǎn)物。49.細胞因子cytokines：由健康人血細胞增殖、分離、提純或由重組DNA技術(shù)制成地多肽類或蛋白質(zhì)類制劑。簡答：生物藥物特性藥理學特性：活性強、治療針對性強、毒副作用少、營養(yǎng)價值高、可能具有免疫原性；理化特性：含量低、雜質(zhì)多、工藝復雜、收率低、組成結(jié)構(gòu)復雜、空間結(jié)構(gòu)決定生物活性、活性高、有效劑量小。生化制藥工藝中分離純化的特點生物材料組成復雜、目的物含量低、易變性失活、分離方法有很大經(jīng)驗成分、步驟多、產(chǎn)品驗證與化學上純度概念不完全相同。分離純化原理根據(jù)分子形狀與分子大小、根據(jù)電荷差異、根據(jù)分子極性與溶解度大小、根據(jù)吸附特性、根據(jù)生物配基特性鹽析的步驟：鹽溶→鹽析（血漿→硫酸銨飽和濃度為30%→提取上清液→硫酸銨飽和濃度為33%→沉淀γ-球蛋白）有機溶劑沉淀法優(yōu)點：乙醇等有機溶劑易除去，產(chǎn)品更純凈；密度差較大，離心收集。缺點：容易使蛋白質(zhì)變性，操作常需低溫，成本高，需防火防爆。吸附法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作簡便、價廉、安全。少用或不用有機溶劑，吸附過程中PH變化小，較少引起生物活性物質(zhì)的變性失活。缺點：選擇性差，收率不高；一些無機吸附劑性能不穩(wěn)定。凝膠層析的特點操作簡便，所需設(shè)備簡單；分離效果好，重復性高；分離條件緩和；應(yīng)用廣泛；分辨率不高，分離操作較慢。離子交換樹脂交聯(lián)度代表什么意義交聯(lián)度上升，膨脹度下降，K值增大，樹脂潛在的選擇能力提高；要有一定的膨脹度保證保證大分子可進入顆粒內(nèi)部。親和層析對載體的要求充分功能化，與配基進行共價連接；有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性；具有高度的水不溶性和親水性；具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能使被親和吸附的大分子自由通過；應(yīng)為大小均勻的剛性小球。氨基酸類藥物的制造方法：蛋白水解法、化學合成法、發(fā)酵法、酶法。蛋白質(zhì)水解法：以毛發(fā)等蛋白質(zhì)為原料，通過酸堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸。發(fā)酵法：借助微生物在有氧或無氧條件下進行生命活動制備微生物菌體或其代謝產(chǎn)物的過程。酶轉(zhuǎn)化法：在特定酶的作用下使某些有機物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸?；瘜W合成法：以酸、醛、酯及某些氨基酸為原料，經(jīng)氨解、水解、縮合、取代及氫化還原等化學反應(yīng)合成氨基酸。蛋白質(zhì)提取分離純化方法材料選擇（富含所需要蛋白質(zhì)或多肽成分的，易于獲得、易于提取、無害的生物組織。）→提取（最大限度提取有效成分，溶劑選擇是關(guān)鍵）→分離純化（等電點、分子形狀和大小、溶解度、電離性質(zhì)、功能專一性、溶劑系統(tǒng)中的分配等）提取：以溶解性、穩(wěn)定性來選擇合適的溶劑。純化分離方法使用順序：原則：相同性質(zhì)的純化方法一般不重復使用，純化方法順序先后的安排上要考慮到有利于減少工序，提高效率。目前臨床使用的胰島素來源動物胰臟來源：經(jīng)動物胰臟提取或適當提取的豬、牛胰島素。半合成胰島素：以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素。重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素：重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素、速效胰島素、長效胰島素。核酸的提取DNA的提?。阂话闶抢肈NA-核蛋白易溶于1mol/LNaCl溶液而不溶于0.14mol/L。RNA的提?。海豪肦NA-核蛋白易溶于0.14mol/LNaCl溶液而不溶于1mol/L的性質(zhì)，先提取得到RNP。肌苷酸的發(fā)酵生產(chǎn)直接發(fā)酵法二步發(fā)酵法：發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷；肌苷磷酸化半合成法生產(chǎn)肌苷酸：在發(fā)酵過程中添加前體物次黃嘌呤后，經(jīng)由微生物產(chǎn)生的胞外酶轉(zhuǎn)化成肌苷酸。核酸制備的方法水解法、發(fā)酵法、半合成法酶類藥物的提取和純化原料選擇→生物材料的預處理→提取→濃縮→純化→結(jié)晶動物材料預處理：機械法、凍融（冷到-10℃左右，再緩慢溶解至室溫，反復多次）、丙酮粉（組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉）酶的結(jié)晶方法鹽析法、有機溶劑沉淀法、復合結(jié)晶法、透析平衡法、等電點法條件選擇：酶的純度、酶的濃度、金屬離子、晶種、溫度、時間、ph注意事項：防止酶蛋白變性；防止輔因子丟失；防止酶被蛋白水解酶降解黏多糖在結(jié)構(gòu)上的特點：黏多糖基本上是由特殊的重復雙糖單位構(gòu)成，在此雙糖單位中包括一個N-胰腺氨基己糖；黏多糖的組成結(jié)構(gòu)單位中有兩種糖醛酸兩種氨基己糖；還有若干其他單糖作為附加成分多糖分離純化的一般方法原料→提取→除蛋白→透析→沉淀→粗品→純化抗生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1.青霉素發(fā)酵工藝的建立對抗生素工業(yè)有何意義？青霉素是發(fā)現(xiàn)最早，最卓越的一種B-內(nèi)酰胺類抗生素，它是抗生素工業(yè)的首要產(chǎn)品，青霉素是各種半合成抗生素的原料。青霉素的缺點是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對革蘭氏陰性菌無效。青霉素經(jīng)過擴環(huán)后，形成頭孢菌素母核，成為半合成頭孢菌素的原料。2.如何根據(jù)青霉素生產(chǎn)菌特性進行發(fā)酵過程控制？青霉素在深層培養(yǎng)條件下，經(jīng)歷7個不同的時期，每個時期有其菌體形態(tài)特性，在規(guī)定時間取樣，通過顯鏡檢查這些形態(tài)變化，用于工程控制。第一期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第二期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第三期：形成脂肪包含體，積累儲蓄物，沒有空洞，嗜堿性很強。第四期：脂肪包含體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第五期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀。脂肪包含體消失，青霉素產(chǎn)量提高。第六期：出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀，釋放游離氨，pH上升。第七期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。一到四期為菌絲生長期，三期的菌體適宜為種子。四到五期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工藝措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前發(fā)束發(fā)酵。3.青霉素發(fā)酵工程的控制原理及其關(guān)鍵點是什么？控制原理：發(fā)酵過程需連續(xù)流加葡萄糖，硫酸銨以及前提物質(zhì)苯乙酸鹽，補糖率是最關(guān)鍵的控制指標，不同時期分段控制。在青霉素的生產(chǎn)中，及時調(diào)節(jié)各個因素減少對產(chǎn)量的影響，如培養(yǎng)基，補充碳源，氮源，無機鹽流加控制，添加前體等；控制適宜的溫度和ph，菌體濃度。最后要注意消沫，影響呼吸代謝。4.青霉素提煉工藝中采用了哪些單元操作？青霉素不穩(wěn)定，發(fā)酵液預處理、提取和精制過程要條件溫和、快速，防止降解。提煉工藝包括如下單元操作：①預處理與過濾：在于濃縮青霉素，除去大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學特征，便于后續(xù)的分離純化過程。②萃?。浩湓硎乔嗝顾赜坞x酸易溶于有機溶劑，而青霉素易溶于水。③脫色：萃取液中添加活性炭，除去色素，熱源，過濾，除去活性炭。④結(jié)晶：青霉素鉀鹽在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸鉀-乙醇溶液，青霉素鉀鹽可直接結(jié)晶析出。氨基酸發(fā)酵工藝1.如何對谷氨酸發(fā)酵工藝過程進行調(diào)控？發(fā)酵過程流加銨鹽、尿素、氨水等氮源，補充NH4+；生物素適量控制在2-5μg/L；pH控制在中性或微堿性；供氧充足；磷酸鹽適量。2.氨基酸生產(chǎn)菌有什么特性，為什么？L-谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中。具有下述共同特性：①細胞形態(tài)為短桿至棒狀；②無鞭毛，不運動；③不形成芽孢；④革蘭氏陽性；⑤生物素缺陷型；⑥三羧酸循環(huán)、戊糖磷酸途徑突變；⑦在通氣培養(yǎng)條件下產(chǎn)生大量L-谷氨酸。3.生物素在谷氨酸發(fā)酵過程中的作用是什么？生物素是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA的輔酶。生物素缺陷型菌種因不能合成生物素，從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。而不飽和脂肪酸是磷脂的組成成分之一。因此，磷脂的合成量也相應(yīng)減少，這就會導致細胞膜結(jié)構(gòu)不完整，提高細胞膜對谷氨酸的通透性，解除其對谷氨酸脫氫酶的抑制，源源不斷生產(chǎn)谷氨酸。維生素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1.比較分析現(xiàn)行維生素C的兩種生產(chǎn)工藝過程及本質(zhì)區(qū)別，有什么優(yōu)勢？現(xiàn)行的維生素c生產(chǎn)工藝過程有：萊氏化學合成法和兩步發(fā)酵法。萊氏化學合成法：D-葡萄糖為原料，進過催化氫化生成D-山梨醇，然后生物氧化轉(zhuǎn)變?yōu)長-山梨糖，酸性液中丙酮化，對α-β-二仲醇進行保護。L-山梨糖高錳酸鉀在堿性溶液中氧化為二丙酮-2-酮-L-古龍酸，除去丙酮，內(nèi)酯化和烯醇化得到L-抗壞血酸。整個合成過程必須保持第4位碳原子的構(gòu)型不變。兩部發(fā)酵法：①催化氫化：催化氫化D-葡萄糖，控制壓力，在氫做還原劑、鎳做催化劑的條件下，將醛基還原成醇基，從而制備D-山梨醇。②第一部發(fā)酵：D-山梨醇C2位羥基氧化為羰基，其他基團不變，微生物轉(zhuǎn)化得L-山梨糖。③第二部發(fā)酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸需要將C1位醇基氧化為羧基，保持其他基團不發(fā)生變化。其中兩步發(fā)酵法更具有優(yōu)勢。原因如下：①以生物氧化代替化學氧化簡化了生產(chǎn)工藝。②省略了丙酮化反應(yīng)步驟，節(jié)省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆設(shè)備，節(jié)約了成本，有利于安全生產(chǎn)。③三廢和污染較小。④提高了生產(chǎn)能力。2.維生素C的生產(chǎn)工藝中，手性中心是如何實現(xiàn)的？維生素C分子中含有兩個手性碳原子，故有四個光學異構(gòu)體。其中L(+)-抗壞血酸括性最高，D（-）-異抗壞血酸活性僅為其20％，工業(yè)上將其作為食品抗氧劑。D(-)-抗壞血酸和L(+)-異抗壞血酸幾乎無活性。3.在未來，一步發(fā)酵能取代兩部發(fā)酵，成為維生素生產(chǎn)的主流工藝嗎，為什么？一步法發(fā)酵對工業(yè)菌株的山梨醇/糖旁路代謝途徑進行敲除。與原始菌株比較，發(fā)現(xiàn)單菌發(fā)酵24h后，培養(yǎng)基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相對于原始菌株殘?zhí)橇刻岣吡?5.9%?；蚬こ讨扑幑に?.工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？碳源：大腸桿菌以蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)為碳源。氮源：不同工程菌對氮源利用能力差異大，具有很高的選擇性。大腸桿菌利用酵母粉等大分子有機氮源；酵母利用氨基酸為氮源。選擇劑：基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇劑；基因工程酵母菌常用氨基酸營養(yǎng)缺陷型。2.影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？溫度：生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達量大，易形成包涵體。策略：較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞。策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。pH：了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。溶解氧：從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度之上。3.誘導物對生長和產(chǎn)物合成有何影響，為什么？誘導物用來誘導表達型工程菌。在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。適宜的誘導時間非常重要。誘導物的濃度及其發(fā)酵溫度會影響表達量和產(chǎn)物存在形式?；瘜W誘導型啟動子：lzc、tac、T7等，誘導時間為對數(shù)生長期。溫度誘導型啟動子：PL、PR等，誘導時間為對數(shù)期或稍后一些。基因工程制藥工藝1.什么是基因工程菌，工程菌構(gòu)建的基本過程和各階段的主要任務(wù)是什么，所涉及基因工程原理是什么？將目的基因?qū)爰毦w內(nèi)使其表達，產(chǎn)生所需要的蛋白的細菌稱為基因工程菌。工程菌構(gòu)建的基本過程如下：目標基因克?。≒CR、文庫篩選、化學合成）→表達載體構(gòu)建（酶切、鏈接）→遺傳轉(zhuǎn)化與篩選（外源基因?qū)肱c培養(yǎng)）→工程菌（獲得新形狀、功能、產(chǎn)生物質(zhì)）酶切：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應(yīng)的限制性片段。（DNA+緩沖液+限制性內(nèi)切酶；37℃，1小時；加熱、加EDTA終止；電泳檢查酶切完整性）鏈接：DNA雙鏈上相鄰的3’羥基和5’磷酸基團共價結(jié)合形成3’-5’磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。（載體片段和基因片段，緩沖液，連接酶；16-26℃，數(shù)小時；70℃加熱10min終止反應(yīng)）轉(zhuǎn)化：把外源基因?qū)胨拗骷毎倪^程。（氯化鈣法向大腸桿菌導入外源基因）2.目標基因克隆的主要方法有哪些？分析其特點及其適用范圍①PCR擴增。優(yōu)點：簡便快速，高效，數(shù)kb單基因克隆。缺點：DNA聚合酶活性和保真性限制。（94℃變性→55℃退火→72℃延伸→94℃變性……）②文庫篩選。優(yōu)點：長片段，無堿基錯誤，位置序列基因克隆。缺點：繁瑣，過程復雜，耗時，昂貴。③化學合成：簡便，準確，已知序列基因克隆，引物合成。缺點：受合成儀性能限制，長度很短。3.大腸桿菌中高效表達蛋白藥物著重設(shè)計哪幾個方面？為了確保工程菌構(gòu)建的有效性，必須遵循GMP及其有關(guān)生物制品研究技術(shù)指導原則，做好菌種的記錄和管理。①表達載體，詳細記錄表達載體，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。②宿主細胞:詳細記錄宿主細胞的資料，包括細胞株系名稱、來源、傳代歷史、鑒定結(jié)果及基本生物學特性等。③目標基因序列:目標基因的序列包括插入基因和表達載體兩端控制區(qū)的核苷酸序列，以及所有與表達有關(guān)的序列，做到序列清楚。重組人干擾素生產(chǎn)工藝1.重組人干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何缺點？①體外誘生干擾素制備工藝：仙臺病毒誘導人白細胞：血漿→人白細胞（病毒誘導）→分離純化→人白干擾素。缺點：產(chǎn)量低，1gIFNα需要105L人血白細胞，來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴，潛在的血源性病毒污染的可能性。②Namalva細胞培養(yǎng)（病毒培養(yǎng)）→合成干擾素→分離純化→多壓型混合干擾素。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，用細胞培養(yǎng)8000L。缺點：活性低，退出臨床應(yīng)用。③工程菌構(gòu)建→發(fā)酵培養(yǎng)→包涵體→復性→重組人干擾素。工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。缺點：生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動物或人血液提取成分，仍然沒有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險。④工程ＣＨＯ細胞系構(gòu)建→細胞培養(yǎng)→收集培養(yǎng)液→分離純化→重組人干擾素。工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高，過程控制嚴格。可以做到無血清培養(yǎng)。⑤基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝。工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時，無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品，純化過程：淘汰抗體親和層析，制劑中采用非人血清白蛋白新型保護劑，使得整個制造過程中不使用任何血液提取成分。2.重組人干擾素發(fā)酵工段的關(guān)鍵控制點是什么，如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？①搖瓶培養(yǎng)：搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250rpm，16-20h；②種子罐培養(yǎng)：接種：接入50L種子罐，接種量10%培養(yǎng)：30℃，pH7.0控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。3.干擾素純化工藝的原理是什么？基于蛋白質(zhì)的電荷性除去雜質(zhì)，準確控制緩沖液和上樣液的pH及電導值，純化干擾素4.干擾素純化工藝過程中各工段的目的是什么？①溶解粗干擾素：配置緩沖液（超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45μm濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級層流下收集），冷卻至2-10℃。在均漿器中完全溶解粗干擾素。②等點沉淀與疏水層析：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液（含有人干擾素）。用NaOH調(diào)節(jié)上清液pH7.0，并用5MNaCl調(diào)節(jié)溶液電導值180ms/cm，上樣，進行疏水層析，利用干擾素的疏水性進行吸附。在2-10℃下，用0.025M磷酸緩沖液（pH7.0）+1.6MNaCl進行洗滌，除去非疏水性蛋白。用0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）進行洗脫，收集洗脫液，干擾素?；颌诘入婞c沉淀與鹽析：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導值40ms/cm，2-10℃靜置過夜，除雜蛋白。1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。調(diào)整溶液pH8.0，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。③陰離子交換層析與濃縮：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂，鹽濃度線性梯度5~50ms/cm進行洗脫，2-10℃，配合SDS收集干擾素峰。把目標餾分合并，調(diào)整溶液pH和電導值，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（5.0）中透析。④陽離子交換層析與濃縮：用0.1M醋酸緩沖液（pH0.5）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度5-50ms/cm進行洗脫，配合SDS收集干擾素峰。合并餾分，10ku超濾膜系統(tǒng)。⑤凝膠過濾層析：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂。上樣，相同洗脫液進行洗脫。合并干擾素部分。⑥無菌過濾分裝：0.22μm膜過濾干擾素溶液，分裝，-20℃以下的冰箱中保存。動物細胞培養(yǎng)制藥工藝1.離體動物細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝特征是什么？蛋白質(zhì)的合成、修飾、分泌功能與制藥有何關(guān)系？葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸。丙酮酸經(jīng)TCA循環(huán)，氧化產(chǎn)生CO2和水，釋放能量。葡萄糖一小部分進入PPP途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。谷氨酰胺：作為氮源，轉(zhuǎn)氨、脫氨（為主），合成非必需氨基酸。大多數(shù)谷氨酰胺通過脫氨生成谷氨酸，并釋放銨離子。小部分谷氨酰胺通過轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體。氨基酸在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體上，以mRNA為模板，進行密碼翻譯，生成蛋白質(zhì)的多肽鏈。在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體內(nèi)加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)。糖基結(jié)構(gòu)易變化，不同細胞系糖基化特征不同，要根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)選擇適宜細胞系。2.制藥動物細胞系的種類和特點有哪些？有限細胞系：是生長和壽命有限的細胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。有限生長，無致瘤性，有接觸抑制性。e.g.2BS。壽命取決于細胞來源的物種和年齡、器官。胚成纖維細胞人（50代），雞胚（30代），小鼠（8代）無限細胞系：壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細胞系或連續(xù)細胞系。沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。人源細胞系：Namalwa，WI-38，MRC-5哺乳動物細胞系：CHO，貼壁或懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。BHK-21，C127，Vero雜交瘤細胞系：脾臟B細胞與骨髓瘤細胞通過原生質(zhì)體融合，獲得的雜交細胞。無血清培養(yǎng)，高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達3.與大腸桿菌和酵母系統(tǒng)相比，哺乳動物源細胞系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點，如何選擇？CHO細胞：Chinesehamsterovary，中國倉鼠卵巢，亞二倍體核型，2n=22。特點：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。最為普遍和成熟表達糖基化蛋白藥物的細胞。多種衍生突變株，高表達。BHK-21細胞：成纖維樣細胞，非整倍體，2n=44.用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。C127細胞，貼壁生長，適合于牛乳頭病毒DNA載體的轉(zhuǎn)化。Vero細胞：多倍體核型，貼壁依賴性。Vero6最為常用，增至病毒，生產(chǎn)疫苗。4.工程動物細胞系的建立：基本過程，表達載體設(shè)計，轉(zhuǎn)化與培養(yǎng)方案篩選和鑒定方法。它們與基因工程微生物的異同是什么？5.動物細胞培養(yǎng)基組成成分及其作用是什么？與微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)基相比，有何特殊性？動物細胞培養(yǎng)基的成分主要有糖類、氨基酸、維生素與無機鹽、激素及附加成分。作用：糖類提供細胞生長的碳源和能源。分解后釋放出能量ATP。氨基酸可通過生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?，間接提供能量。維生素既不是細胞的物質(zhì)基礎(chǔ)，也不是能量物質(zhì)，對代謝和生長起調(diào)節(jié)和控制作用。無機鹽是細胞代謝所需酶的輔基，同時保持細胞的滲透壓和緩沖PH的變化。激素對細胞的生長有刺激作用。貼附因子的作用是讓細胞的貼壁生長。6.生產(chǎn)用最適動物細胞培養(yǎng)基應(yīng)該選擇哪種，為什么？合成培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定，容易配置。已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化7.如何控制動物細胞培養(yǎng)基的質(zhì)量？培養(yǎng)用水質(zhì)：必須按照GMP要求進行制備，除去普通水中的各類元素、有毒或有害物質(zhì)及微生物和熱源，達到純水標準。緩沖液：H2CO3/NaCHO3；NaH2PO4/Na2HPO4；恒定pH。平衡鹽溶液：BBS，由NaCl、無機鹽和葡萄糖、緩沖劑、指示劑組成。滿足細胞對鹽離子、碳營養(yǎng)要求；pH和滲透壓要求；直觀觀察pH。磷酸鹽緩沖液：PBS，KCl、KH2PO4、NaCl、NaHPO4。培養(yǎng)物、器皿的洗滌液。氨基酸配置：50倍濃縮液。使用L型氨基酸，對于DL混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍。谷氨酰胺不穩(wěn)定，需單獨配置（100倍濃縮液，-20℃保存）。8.基質(zhì)依賴性與非依賴性細胞系對培養(yǎng)條件的要求有什么不同？如何滿足？貼壁依賴性細胞：依賴于生長基質(zhì)，并在表面才能生長的細胞。只能貼壁生長。多數(shù)天然細胞。非貼壁依賴性細胞：不依賴于生長基質(zhì)，可懸浮生長。淋巴細胞、雜交瘤細胞、腫瘤細胞。生長基質(zhì)：改變介質(zhì)表面特性，支撐、促進動物細胞貼附的物質(zhì)。為支持介質(zhì)表面提供適量帶正電荷，細胞被吸附在介質(zhì)上。9.細胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種方法，有何特點，如何選擇應(yīng)用？①單層貼壁培養(yǎng)。單層貼壁培養(yǎng)是指把細胞貼附于一定的固體支持表面上，生長形成單層細胞的培養(yǎng)方法，適合于貼壁依賴性細胞培養(yǎng)。②懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)是指細胞在細胞反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長的培養(yǎng)過程，主要對于非貼壁性依賴性細胞，如雜交瘤細胞。③微囊培養(yǎng)。把動物細胞包埋在微載體內(nèi)或膠囊內(nèi)固定化后，進行懸浮培養(yǎng)，適合于貼壁依賴性和非貼壁依賴性細胞。④微載體培養(yǎng)。微載體是三維培養(yǎng)系統(tǒng)，有很大的比表面積，細胞貼附于載體上增值，再懸浮于細胞液中，兼具有貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點。10.比較微生物發(fā)酵控制過程的異同動物細胞微生物溫度在線，恒溫，水套層，電熱片，加溫三基點，發(fā)酵熱對生長和生產(chǎn)影響，變溫控制，降溫攪拌，泡沫低轉(zhuǎn)速，加剪切保護劑，消沫劑基于供氧與混合，化學消沫劑與分散劑，機械消沫溶解氧臨界氧濃度供氧與耗氧的平衡，臨界氧濃度之上CO2需要通入，調(diào)節(jié)pH尾氣，呼吸強度pH恒定，緩沖劑，通氣，補料，綜合控制三基點，變pH，加酸/堿；緩沖劑，補料代謝檢測與分析底物消耗，副產(chǎn)物生成，胞內(nèi)代謝，分泌底物消耗，產(chǎn)物的生成，生物化學變化補料補充營養(yǎng)，控制代謝過程解除底物抑制，增加前體放料解除副產(chǎn)物，收獲產(chǎn)物解除產(chǎn)物抑制重組人紅細胞生成素的生產(chǎn)工藝1.比較各種表達系統(tǒng)生產(chǎn)rhEPO的優(yōu)缺點。①SV40病毒啟動子的表達載體，在COS-1中瞬時表達hEPO。②昆蟲SF9細胞中桿狀病毒載體表達rhEPO。產(chǎn)率有所改善，糖基化程度較小。③家蠶系統(tǒng)表達，糖基化簡單，藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性較低、活性較差等問題。④大腸桿菌表達，僅具體外抗原結(jié)合活性。⑤干擾素-α基因啟動子的rhEPO表達載體，BALL-1細胞，產(chǎn)生較高量的rhEPO。⑥CHO、BHK細胞中穩(wěn)定表達，rhEPO與天然EPO結(jié)構(gòu)、活性相似。2.CHO培養(yǎng)生產(chǎn)rhEPO的基本工藝過程及其控制點是什么，為什么？①復蘇：液氮凍存的CHO細胞系在37℃中水浴快速融化。無菌離心，棄上清。②培養(yǎng)：加適量DMEM（10%小牛血清），37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳三代。③消化：用胰蛋白酶消化貼壁細胞后，制成細胞濃度約為2.5×106個/ml。用于接種。④反應(yīng)器滅菌：加纖維素載體片及pH7.0的PBS緩沖液，高壓滅菌。⑤接種：排出PBS緩沖液，加DMEM培養(yǎng)基（含10％血清），接入種子細胞。⑥貼壁培養(yǎng)：pH7，<50r/min，37℃，DO50-80%。⑦擴增培養(yǎng)：80－100r/min。pH7，37℃。⑧灌流培養(yǎng)：控制溫度、DO、pH值等培養(yǎng)條件，進行無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)。⑨收獲培養(yǎng)物：連續(xù)收獲，4℃－8℃保存。控制點：①攪拌控制：接種后,攪拌速度緩慢，使細胞貼附于載體上，隨著細胞數(shù)量的增加逐漸提高攪拌速度。②溫度控制：較為嚴格，恒定37℃③pH值控制：7.2-7.4,輸入CO2和碳酸氫鹽溶液維持其恒定。④溶解氧控制：在50-80％的范圍內(nèi)，通入氧氣、空氣、氫氣或氮氣的比例混合氣體。⑤葡萄糖控制：流加補料⑥代謝廢物控制：監(jiān)測銨、乳酸鹽類等，維持較低濃度，減少對細胞損害。3.rhEPO分離純化工藝中使用了哪些操作單元，為什么？收獲培養(yǎng)液、透析、過濾、DEAE離子交換、凝膠過濾。三廢處理工藝1.簡述制藥企業(yè)清潔生產(chǎn)的途徑①資源綜合利用——原料資源的綜合利用、水資源的綜合利用、二次資源綜合利用、廢物綜合利用；②改革工藝和裝備——原料處理工藝的改革、產(chǎn)品制造工藝的全過程統(tǒng)籌、裝備技術(shù)的更新；③改進操作和加強管理；④必要的末端處理。2.簡述制藥工業(yè)的末端污染特點制藥廠排出的污染物通常具有毒性、刺激性和腐蝕性?；瘜W制藥廠的污染物還具有數(shù)量少