利用表面等離子共振傳感器檢測轉基因植物中蘇云金芽孢桿菌carloc12a蛋白

利用表面等離子共振傳感器檢測轉基因植物中蘇云金芽孢桿菌carloc12a蛋白

太陽金蘑菇（bt）是一種分布廣泛的太陽陽性細菌。如果枝條形成，它將產生殺死活性物質的晶體蛋白質，稱為寄生蟲晶體蛋白（cp）。利用轉基因技術將Bt基因導入植物中,改良植物品種,使改良后的植物具有抗蟲基因,可有效殺滅多種害蟲。在節(jié)省害蟲防治成本的同時,還能緩解因大量施用農藥而造成的環(huán)境污染。目前已有多種轉Bt基因農作物實現(xiàn)了商業(yè)化種植,如玉米、棉花、馬鈴薯、番茄等。然而,由于轉基因產品的安全性問題一直備受關注,各國對于轉基因產品的種植和進口都有著嚴格的規(guī)定,因此研究出一種簡便快捷地檢測轉Bt基因作物的方法具有重要的現(xiàn)實意義。本研究針對Bt蛋白中的Cry2A蛋白進行檢測研究,Cry2A蛋白能同時殺滅鱗翅目害蟲和雙翅目害蟲。表面等離子共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技術是近些年得到長足發(fā)展的一項應用于分析生物分子間相互作用的檢測技術[9,10,11,12,13,14],而表面等離子共振傳感器便是基于這種技術的一種光學傳感器,它利用全反射時入射光可以和金屬表面的等離子發(fā)生共振的原理,檢測生物分子之間的相互作用與結合過程以及動力學反應。相比其他檢測方法,SPR方法具有以下幾個優(yōu)點:1)檢測樣品不需標記,避免了樣品因為標記不當而失去活性;2)可做到動態(tài)實時監(jiān)測;3)檢測過程非常簡便且靈敏度高。目前該技術已廣泛應用于食品分析、蛋白質與核酸檢測、藥物篩選、臨床醫(yī)學等各個領域。本實驗便是基于這種技術,利用SPR傳感器對Bt抗蟲蛋白Cry2A進行了檢測研究。1材料和方法1.1a中國上海有限公司單側鍍金玻璃片(12mm×20mm,單側鍍金50nm)、SPRNavi200傳感器芬蘭BioNavis公司;蒸餾水;無水乙醇;30%氨水、30%雙氧水均為分析純;巰基十一酸(11-mercaptoundecanoicacid,11-MUA)Sigma中國上海有限公司;3-巰基丙酸(3-mercaptopropionicacid,3-MPA)、脂肪酸甲酯磺酸鹽(fattyacidmethylestersulfonate,MES)、N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(1-hydroxy-5-pyrrolidinedione,NHS)、Cry2A蛋白及其單克隆抗體、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、磷酸鹽(phosphatebufferedsaline,PBS)緩沖液(20mmol/LNaH2PO4,150mmol/LNaCl,pH7.4)、DHG-9030恒溫干燥箱北京江陰濱江設備公司;Cry2A蛋白檢測試劑盒美國Envirlogix公司。1.2方法1.2.1金片的表面清洗將30%氨水、30%雙氧水、蒸餾水按照1∶1∶5的體積比混合,把金片置入其中,于水浴鍋中煮沸,溫度設置為80~90℃,10min后取出,用蒸餾水及無水乙醇分別清洗金片表面,氮氣吹干表面,以便用于后續(xù)實驗。1.2.2主要表面活性劑將10mmol/L3-MPA溶液與10mmol/L11-MUA溶液以10∶1的比例混合,把金片鍍金的一面朝上置于其中,浸泡24h;取出金片,用蒸餾水及無水乙醇沖洗金片并用氮氣吹干,于金片表面滴加100μLEDC(0.4mol/L),100μLNHS(0.1mol/L)(EDC、NHS均用MES溶解)以活化金片表面的硫醇羧基,室溫靜置2h后用蒸餾水及無水乙醇清洗金片,氮氣吹干,再次滴加100μLEDC,100μLNHS,室溫靜置2h;蒸餾水及無水乙醇清洗并吹干金片,金片表面滴加100μLCry2A單克隆抗體溶液(0.2mg/mL,PBS稀釋),37℃恒溫箱中靜置3h;蒸餾水洗去表面抗體溶液,氮氣吹干,2mg/mLPBS稀釋,覆蓋于金片表面,室溫靜置2h,用蒸餾水將金片表面清洗干凈,吹干,置于PBS中4℃保存。1.2.3溫度設定及過程取出金片,用蒸餾水洗凈,氮氣吹干,將金片放入SPR傳感器的指定位置中,打開儀器和監(jiān)測軟件,通入PBS(使用前需超聲),流速為10μL/min,待反應池及棱鏡溫度達到設置溫度后進行初始角度掃描(一般將反應溫度設置為低于室溫1~2℃),找到固定角后進行固定角掃描,待基線穩(wěn)定后,用進樣注射器注入300u2005μL待測樣品溶液(PBS稀釋),通過SPR檢測軟件實時觀察反應過程。1.2.4酶聯(lián)免疫(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法檢測Cry2A蛋白將Cry2A標準樣品稀釋到目標質量濃度,取100μL加入到樣品板中,室溫靜置15min,加入100μL酶標抗體,室溫孵育1h,傾去反應液,拍干,吐溫-PBS緩沖液(tweenPBS,PBST)洗滌3次,加入100μL底物,靜置30min,最后加入100μL終止液,使用酶標儀讀數。2結果與分析2.1spr結果分析將待測抗原Cry2A稀釋成不同質量濃度(10~1000ng/mL),每種質量濃度在同一條件下重復檢測3次,對結果進行分析,計算平均值,結果如圖1所示。進樣后約30s開始產生響應,表明待測樣品流經金片表面時與結合在金片表面的單抗發(fā)生特異性結合,引起金片表面折射率的變化,使SPR角度發(fā)生偏移。樣品質量濃度越高,響應值越大,說明結合在金片表面的抗原越多。從實驗結果可以看出,使用SPR檢測Cry2A蛋白的最低檢測限為10ng/mL。2.2同一質量濃度對各檢測點發(fā)酵的影響選取4種不同質量濃度的Cry2A蛋白重復檢測3次,表1結果顯示每次檢測都有明顯的反應,且同一質量濃度的響應值差異很小,隨蛋白質量濃度的降低反應響應值也相應減小,表明SPR檢測Cry2A的重復性較好。2.3種蛋白的特異性檢測為了驗證SPR檢測Cry2A蛋白的特異性,選用另外兩種抗蟲Bt蛋白Cry1Ac和Cry2Ab作為對照,3種蛋白均以1μg/mL質量濃度進樣,進行3次特異性檢測實驗。結果如圖2所示,Cry2A蛋白有明顯響應,而Cry1Ac和Cry2Ab蛋白則未出現(xiàn)明顯響應,由此可見此方法檢測Cry2A蛋白具有較好的特異性。2.4濃度3個重復的檢測使用Cry2A檢測試劑盒對不同質量濃度的Cry2A抗原進行了檢測,每個質量濃度3個重復,結果如表2所示。陰性樣品的OD值一般不超過0.2,超過0.2均視為陽性樣品,故ELISA法檢測Cry2A蛋白的靈敏度可達10ng/mL,與SPR方法靈敏度相當,但SPR方法具有免標記、操作簡便、快捷的優(yōu)勢。3配合物的質譜檢測轉基因產品的安全問題一直備受關注,我國政府高度重視轉基因植物安全檢測工作。因此,對于轉基因產品檢測新方法的研究具有重大的現(xiàn)實意義。SPR傳感器是近年來迅速發(fā)展起來的新型檢測儀器。近30a來,SPR傳感器在技術發(fā)展和應用領域等方面都有很大的進步,現(xiàn)已成為一種檢測生物分子間相互作用的核心手段,且SPR檢測金片可反復使用30次左右,降低了實驗成本。但SPR技術在靈敏度、多通道檢測等方面還有不足。在靈敏度方面目前SPR技術還無法準確檢測到一些低濃度、小分子質量的分子。在實現(xiàn)多通道檢測方面,目前SPR傳感器僅可同時檢測兩組數據。以上兩方面問題將是今后SPR檢測研究的主要方向。本實驗基于抗原抗體特異性結合的原理,運用SPR檢測技術,研究建立了Cry2A蛋白的新的檢測方法。該方法檢測靈敏度可達10ng/mL,與傳統(tǒng)的