天麻共生蜜環(huán)菌生長特性研究

天麻共生蜜環(huán)菌生長特性研究

蜂蜜環(huán)菌（dap：fr.）p.kumm。它也被稱為榛子和榛子，是傘菌科、白加爾和蜂蜜環(huán)菌科的一種選擇性寄生蟲。蜜環(huán)菌是名貴中藥材天麻塊莖生長過程中必不可少的共生菌,因為蜜環(huán)菌在生長過程中能產(chǎn)生菌索,菌索又從為其提供營養(yǎng)物質的基物中伸出,而進入到另一個不支持其生長的基物中生長,行使運輸營養(yǎng)和水分的功能,天麻在完成生活史過程中,原球莖階段靠同化蜜環(huán)菌進行正常生長,大量研究表明,蜜環(huán)菌的生長特性對天麻的產(chǎn)量和品質有很大影響。云南昭通市是我國公認的天麻地道藥材產(chǎn)地,特別是昭通市彝良縣小草壩所產(chǎn)的天麻,昭通天麻的原植物有烏天麻(GastrodiaelstaBl.f.glauca.)、黃天麻(GastrodiaelstaBl.f.flavida.)、紅天麻(GastrodiaelstaBl.f.elata.)、綠天麻(GastrodiaelstaBl.f.viridis.)4個變型,昭通人工種植的天麻主要是烏天麻和紅天麻2個變異類型。因此,從昭通本地篩選與昭通天麻共生的優(yōu)良蜜環(huán)菌菌株,對保持昭通天麻的優(yōu)良品質和提高其產(chǎn)量具有重要意義。1材料和方法1.1天麻菌材的分離4株昭通本地蜜環(huán)菌SNA01,SNA02,SNA03,SNA04分別自昭通野生天麻及野生天麻生長點的菌材上分離獲得,京-234由陜西漢中植物研究所提供。1.2半固體培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL)、GPY半固體培養(yǎng)基(葡萄糖20g、蛋白胨6g、酵母膏10g、瓊脂5g、水1000mL),按常規(guī)方法制作。試管PDA平面培養(yǎng)基:配置PDA培養(yǎng)液,裝入試管中,不超過2/3,滅菌后,豎立放置至培養(yǎng)基冷卻。1.3測試方法1.3.1生長情況觀察在試管PDA平面培養(yǎng)基上接種蜜環(huán)菌菌種,每管接種量為長0.7cm的成熟菌索段,在25℃下靜止暗培養(yǎng),每24h觀察1次生長情況,記錄生長速度,每組3次重復。1.3.2菌種形態(tài)觀察和培養(yǎng)將100mL培養(yǎng)基裝入250mL三角瓶中,用棉塞封口,121℃滅菌30min,冷卻后挑取1塊直徑為0.5cm的圓形菌塊于培養(yǎng)基上,在25℃下暗培養(yǎng)18d后,觀察菌絲體和菌索的形態(tài)特征,然后在鐵絲網(wǎng)上用自來水沖洗菌索上附著的半固體培養(yǎng)基,洗凈后的培養(yǎng)物在50℃下烘干,冷卻后稱其質量,每組3次重復。1.3.3生長特性觀察在PDA平板培養(yǎng)基上接種蜜環(huán)菌菌種,每皿接種1根長0.7cm的成熟菌索段,接種后于25℃、空氣濕度80%的條件下靜止暗培養(yǎng),每24h觀察1次生長情況,并記錄菌絲萌發(fā)和菌索開始生長的時間,菌索形態(tài)、生長狀況及熒光反應等生長特性。2結果與分析2.1菌索生長速度5株蜜環(huán)菌在PDA培養(yǎng)基上菌索的生長速度測定結果見表1。表1顯示,5株蜜環(huán)菌在相同生長條件下菌索平均生長速度存在差異,對照發(fā)現(xiàn),優(yōu)良菌株京-234的菌索生長速度最快,平均達1.05cm/d。4株昭通蜜環(huán)菌中生長速度最快的是SNA04,平均生長速度為0.97cm/d,僅比京-234的平均生長速度慢了0.08cm/d。SNA01菌株的生長速度最慢,平均0.60cm/d,僅為京-234和SNA04菌索生長速度的0.57倍和0.62倍。5個菌株菌索生長速度經(jīng)方差分析,F=4.48﹥F0.05=3.54,P=0.025﹤0.05,說明各菌株間菌索生長速度存在顯著差異。2.2京-1333菌株的生物量5株蜜環(huán)菌在25℃下暗培養(yǎng)18d后菌索生物量見表2。表2顯示,5株蜜環(huán)菌經(jīng)相同時間生長后生物量存在明顯差異,SNA04的生物量最大,達1.3765g,比對照菌株京-234的生物量(1.1492g)高約20%。而其他3菌株的生物量均低于京-234,其中SNA01的生物量最小,僅為0.8029g,較生物量最大的SNA04低約71%,較京-234低約43%。菌株SNA02和SNA03之間的生物量差異不大,分別比京-234低約18%和12%。經(jīng)方差分析,F=4.054﹥F0.05=3.54,P=0.033<0.05,差異顯著,說明各菌種之間的生物量存在顯著差異。2.3光反應強度檢測5個菌株在25℃下培養(yǎng)時,各菌株菌絲萌發(fā)、菌索開始生長時間、菌索分枝狀況及熒光反應強度等生長特性有所不同,尤其是菌索的分枝特征和熒光反應強度尤為明顯,結果見表3。本地菌株SNA04和SNA03的菌索分枝多,生長均勻,熒光反應強烈,且SNA04的菌索具有棘狀分枝而SNA03的菌索較粗;對照發(fā)現(xiàn),菌株京-234的菌索較粗,菌絲的熒光反應一般,但菌索分枝少且生長極不均勻。而SNA01和SNA022個菌株的熒光反應弱,生長不均勻,且SNA01菌索分枝少,而SNA02雖菌索較粗,分枝多,但菌索的顏色較深而且有大量黑色素產(chǎn)生。3不同種類的蜜環(huán)菌與天麻目前,篩選優(yōu)良蜜環(huán)菌主要依據(jù)菌索生長速度、生物量、分枝狀況,菌絲萌發(fā)和菌索產(chǎn)生的時間及熒光反應強弱。本研究從以上幾點出發(fā),對昭通本地的4株天麻共生蜜環(huán)菌和1株外來優(yōu)良天麻共生蜜環(huán)菌進行了研究,本地菌株SNA04除菌索生長速度略低于京-234外,菌索生物量、分枝狀況、熒光反應強度等特性均強于京-234,為所有篩選菌株中表現(xiàn)最突出的菌株。菌株SNA03菌索分枝性狀良好,熒光反應強烈,但菌索生長速度較慢且生物量也不及SNA04,而菌株SNA01和SNA02則在各方面均無突出表現(xiàn)。因此,4株本地蜜環(huán)菌中,SNA04菌株的性狀最優(yōu),SNA03次之。但SNA04和SNA03菌株與昭通天麻是否具有良好的共生關系,還有待于進一步的野外觀察證明。不同種類的蜜環(huán)菌自然分布在不同的地理區(qū)域。云南省昭通市是我國公認的天麻地道藥材產(chǎn)地,主要分布于五蓮峰山脈和烏蒙山脈的交匯地帶,這一帶由于受特殊的“昆明準靜止峰”氣候類型影響,創(chuàng)造了最適宜天麻生長的環(huán)境。同時此地蜜環(huán)菌種類繁多,但是