腎安提取液對糖尿病腎病小鼠腎臟的影響

腎安提取液對糖尿病腎病小鼠腎臟的影響

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見的并發(fā)癥。晚期糖基化終產物(AGEs)是體內蛋白質與糖在無酶條件下發(fā)生反應后的產物。AGEs濃度的升高與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關,糖基化終產物途徑被認為是糖尿病腎病的重要病理機制。本實驗觀察腎安提取液對糖尿病腎病模型小鼠腎臟AGEs、RAGEs的影響。1材料和方法1.1動物8周齡C57BL/6小鼠54只(購自湖南斯萊克景達實驗公司,實驗動物合格證號:SCXK(湘)2009-0004)。1.2博維sybr腎安提取液(黃芪甲苷、淫羊藿苷、1,8二羥基蒽醌組方比例為2.5∶1.8∶2.8),用0.3%羧甲基纖維素鈉配制成0.3029mg/mL備用;厄貝沙坦(安博維,由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產,批號:1812);鏈脲佐菌素(STZ,購自Sigma公司)。Trizol(Invitrogen公司);逆轉錄試劑盒(TOYOBO,日本);SYBRGreenrealtimePCRmastermix(TOYOBO,日本);免疫組化一抗為兔抗小鼠RAGE多克隆抗體(Santacruz公司);二抗為辣根酶(HRP)標記山羊抗兔IgG(KPL公司);兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(GENETECH公司)。1.3彩色圖像系統(tǒng)Real-timePCRDetectionSystem(SLAN,HONGSHI公司);HMIAS2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影象技術公司);RF-5000熒光分光光度計(日本島津公司)。1.4糖尿病模型成功制備隨機將54只小鼠分為6組,每組9只:正常對照組(N組)、DN模型組(DN組)、厄貝沙坦組(EB組)、腎安高劑量組(SAG組)、腎安中劑量組(SAZ組)、腎安低劑量組(SAD組)。造模方法:適應性喂養(yǎng)1周后,禁食12h,將STZ溶解于pH4.8檸檬酸緩沖液中,按150mg/kg腹腔內一次性注射,同時正常對照組腹腔注射等量無菌檸檬酸緩沖液。注藥后72h尾尖取血,測血糖(ACCU-CHEK血糖儀,羅氏公司),血糖>16.17mmol/L者確定為糖尿病誘導成功,此后監(jiān)測血糖和24h尿蛋白,持續(xù)出現蛋白尿的小鼠視為DN模型成功。造模成功后進行藥物干預。正常對照組、DN模型組小鼠灌服蒸餾水10mL/kg;EB組灌服厄貝沙坦10mg/kg(蒸餾水稀釋至10mL);腎安大劑量為9.088mg/kg,中劑量為4.544mg/kg,小劑量為2.272mg/kg,均采用灌服法。藥物干預時間為4周。1.5樣品采集藥物干預結束后用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取左腎用4%多聚甲醛固定,用于病理切片,右腎-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.6觀察指標1.6.1熒光強度的測定將腎皮質200mg剪碎(冷凍),勻漿,4℃6500r/min離心30min,去上清,沉淀中加氯仿-甲醇(2∶1)去脂,加入1mL甲醇、250μL水,水化,自然沉淀,4℃6500r/min離心30min,去上清液,加入氯仿1μL、甲苯1μL以抑制細菌生長,同時以含Ⅶ型膠原酶的0.1mol/LCaCl2緩沖液作空白對照,37℃輕搖24h,然后4℃8000r/min離心5min,取上清液備用;上清液用熒光分光度計按370/440nm(激發(fā)波/發(fā)射波)測定熒光值;以0.1mol/LCaCl2緩沖液熒光值為1個任意熒光單位(AUF),樣品熒光強度依此折算;腎皮質中蛋白質含量的測定采用Bradfrod的方法,用1g/L的牛血清白蛋白繪制蛋白標準曲線,腎皮質中AGEs含量以AUF/mg表示。1.6.2rages的pcr檢測①引物的設計:根據Genebank中小鼠和actin序列,設計上、下游引物,RAGEs引物:5′-CCGATGGCAAAGAAACACTC-3′,引物2:5′-CTATTCCACCTTCAGGCTCAAC-3′,擴增產物長246bp;actin引物1:5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,引物2:5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,擴增產物長249bp。②總RNA的提取:參考說明書用Trizol試劑提取。③逆轉錄:采用逆轉錄試劑盒,以提取的組織總RNA為模板,以Oligo-dT為引物進行逆轉錄反應。將組織中提取的總RNA8μL、Oligo(dT)201μL、無核酸酶水3μL、5×RTBuffer4μL、dNTP2μL、RNA酶抑制劑1μL、RNA逆轉錄酶1μL依次加入Dorf管內,混合均勻,使總體積為20μL。設置PCR儀程序為:42℃20min,95℃5min,4℃5min。反應完成后總RNA已逆轉錄為cDNA,產物即為PCR反應的模板。④擴增:RAGEs的擴增體系:SYBRGreenmix12.5μL,引物(5pmol/μL)2μL,ddH2O8μL,cDNA(10倍稀釋)2.5μL,擴增條件:50℃2min、94℃5min預變性;94℃30s、59℃30s、72℃1min,循環(huán)設置數為40;終末延伸72℃7min。1.6.3木本糖液顯色顯色法石蠟切片置于65℃烘箱中,烘片2h,脫蠟至水。微波修復,切片放入3%過氧化氫溶液,室溫下孵育10min,以阻斷內源性過氧化物酶。一抗抗體按1∶150稀釋,每張切片加入50μL稀釋液,4℃孵育過夜。每張切片加80μLA液(ChemMateTMEnVision+/HRP),室溫下孵育45min。每張切片加80μL新鮮配制的DAB溶液,室溫下孵育5min,顯微鏡控制顯色。顯色完全后,蘇木素復染,梯度酒精(70%-100%)脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。每張腎臟切片隨機選取腎皮質10個高倍鏡視野(200倍),用HMIAS2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)分析各組小鼠腎皮質RAGEs的平均陽性表達率。1.7統(tǒng)計方法實驗資料用均數±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用t檢驗,結果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理。2結果2.1各組腎安對臟器ragesmrna、rages蛋白表達的影響DN組腎臟RAGEsmRNA、RAGEs蛋白的表達明顯高于N組(P<0.01),EB組、腎安各劑量組腎臟RAGEsmRNA、RAGEs蛋白表達較DN組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表1、圖1。2.2eb組、腎安各劑量對腎安各劑量腎安各劑量對腎ags含量的影響DN組腎臟AGEs含量明顯高于N組(P<0.01),EB組、腎安各劑量組腎臟AGEs含量較DN組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。3腎安提取液對dn腎組織rages表達的影響目前學者認為AGEs途徑是介導腎臟損傷中最主要的途徑之一。許多實驗也證明應用ACEI、ARB均可以使糖尿病腎病腎臟AGEs聚積減少,體外實驗也證明AGEs可激活RAS的許多成分,包括ACE、AT1受體等。應用ACEI、ARB可以延緩慢性腎臟病的進展,但是GFR仍然持續(xù)下降,提示DN時是否激活了其他途徑,也為聯(lián)合應用RAS阻滯劑和AGEs抑制劑提供了合理前提。糖尿病患者體內存在高糖環(huán)境,葡萄糖或其他還原糖與蛋白質的末端氨基酸或ε氨基酸反應,可以形成蛋白質非酶糖基化反應的終產物。AGEs可以與其它蛋白質、核酸大分子物質以及脂類形成巨交聯(lián)物,從而成為脂褐素的基本成分。脂褐素被溶酶體吞噬后,在細胞內堆積,干擾了細胞正常代謝,影響細胞功能并能產生細胞毒性作用,加速細胞老化進程。AGEs與其特異性受體結合而被細胞內呑清除,或者誘導細胞的氧化應激、激活NF-κB增加應激細胞因子的表達、參與凋亡過程等,從而引發(fā)一系列代謝紊亂,在糖尿病腎病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。AGEs能明顯誘導大鼠腎皮質cTGFmRNA和蛋白質表達增強,并使ECM蛋白成分合成增多。AGEs可能通過誘導cTGF表達上調引起EMC合成增多。AGEs能明顯誘導大鼠腎系膜細胞CTGFmRNA的表達,提示AGEs可能通過上調CTGFmRNA的表達引起ECM積聚。人類和其他種屬動物的不同細胞表面存在有多種AGEs受體,其中RAGEs是目前研究的較為深入的一種AGEs受體,RAGEs屬免疫球蛋白超家族成員,可廣泛表達于血管平滑肌細胞、單核巨噬細胞、內皮細胞、腎小球系膜細胞和神經細胞表面。RAGEs作為AGE的信號轉導受體,具有多種不同的生物效應。RAGEs可以介導激活NF-κB而促進靶基因的表達、促炎細胞因子的分泌而參與各種炎癥病理過程;RAGEs還可以通過增強粘附分子、基質金屬蛋白酶-9等的表達,增加損傷部位炎癥,導致內皮細胞功能失調等,促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。RAGEs能夠激活內皮細胞和單核細胞的NADPH氧化酶,誘導氧化應激產生大量活性氧而損傷組織細胞等。研究顯示,在DM患者血管壁及腎臟,RAGEs的表達與正常人相比顯著增加。在腎臟,AGEs與RAGEs結合后可通過產生氧化應激,誘導血小板衍化生長因子、轉化生長因子的表達,促進細胞外基質的產生,增加血管通透性,使血液處于高凝狀態(tài)等機制參與DN的進展。AGEs可通過RAGEs介導腎小管上皮細胞向肌纖維原細胞的轉化,促進糖尿病腎小管間質的硬化。用RAGEs抗體或sRAGE阻斷AGEs與RAGEs的結合可顯著延緩DM大鼠血管病變的發(fā)生、發(fā)展。長期應用sRAGE或抗RAGEs抗體可明顯緩解db/db糖尿病大鼠腎臟損害。中藥可以抑制DN腎臟糖基化終產物對腎臟得損害作用。腎康丸對DN腎臟有保護作用,其機制可能與其降低DN大鼠血清、腎組織AGEs水平以及腎組織RAGEs含量,抑制腎組織RAGEsmRNA的表達有關。枸杞多糖可以降低模型大鼠糖基化終產物的產生,減少腎臟IL-8的分泌,從而預防糖尿病腎病的發(fā)生。腎安提取液是在多年臨床經驗基礎上總結出的治療糖尿病腎病的有效方,由大黃、黃芪、淫羊藿組成,我們既往的實驗研究發(fā)現,大黃蒽醌、黃芪甲苷、淫羊藿苷是其中的主要成分。大黃酸可以抑制TGF-β誘導的腎小球系膜細胞的增生、肥大以及ECM的產生,還可以明顯抑制TGF-β所介導的系膜細胞GLUT1表達與細胞對葡萄糖的異常攝入。洪小平等發(fā)現黃芪可通過多種途徑在基因水平上起到對糖尿病腎病的保護作用,對物質代謝相關基因影響更為明顯。淫羊藿能減少代謝廢物的蓄積,降低大鼠血清膽固醇、甘油三酯,具有抑制腎小球肥大及補體C3、纖維連接蛋白在腎小球毛細血管袢的沉積,減少細胞外基質的產生的作用。本研究發(fā)現,腎安提取液能降低腎組織AGEs含量,抑制糖尿病腎病模型小鼠腎皮質RAGEsmRNA和RAGEs的表達,對DN模型鼠腎臟有保護作用。腎安提取液對C57BL/6DN模型小鼠腎臟的保護作用與藥物劑量有一定關系,腎安提取液高、中、低劑量均能顯著降低模型鼠腎皮質RAGE