腫瘤治療的進(jìn)展

腫瘤治療的進(jìn)展

腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命和健康。傳統(tǒng)的惡性腫瘤的治療手段包括手術(shù)、化療、放療等,但對(duì)很多中晚期腫瘤患者,這些傳統(tǒng)治療方法就顯得力不從心,與此同時(shí)生物治療就成為一種必需的手段?；蛑委熓瞧渲兄?將基因通過(guò)載體轉(zhuǎn)入病人體內(nèi),從而達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的。1990年Anderson首次在臨床上用ADA(腺苷脫氨酶)基因,治療SCID(嚴(yán)重綜合免疫缺乏癥),取得了一定的療效。基因治療的概念一經(jīng)提出,很快被用于腫瘤治療。迄今為止,腫瘤的基因治療在整個(gè)基因治療的臨床方案中占63%以上。盡管人們對(duì)腫瘤的基因治療寄予厚望,但是迄今為止,腫瘤的基因治療在臨床上沒(méi)有重大突破。因此,近些年來(lái),用病毒治療惡性腫瘤又重新成為了科學(xué)研究的熱點(diǎn)。如腺病毒ONYX-015、CV706,單純皰疹病毒G207和G1716,其中ONYX-015合并化療(5-FU與順鉑),取得了一定的進(jìn)展。但如果單用ONYX-015,療效卻不到15%。雖然ONYX-015曾完成了Ⅱ期臨床試驗(yàn),但進(jìn)入Ⅲ期臨床后不久即停止。至今病毒治療腫瘤也無(wú)重大突破。在本文中,我們提出癌癥的靶向基因-病毒治療策略(targetinggene-virotherapyofcancer),即將基因治療與病毒治療各自的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行腫瘤治療的新策略。其基本方法是:在腫瘤特異性增殖病毒(也叫溶瘤病毒)的載體中插入抗癌基因。所謂載體,就是一種基因運(yùn)載工具,將抗癌基因運(yùn)送至體內(nèi)。我們使用的是經(jīng)過(guò)改造的病毒載體,它可特異性導(dǎo)向腫瘤,本身就有一點(diǎn)治療作用,而且它可特異性在腫瘤中復(fù)制,使所攜帶的基因也能特異性在腫瘤中增殖數(shù)十至數(shù)千倍。癌癥的靶向基因-病毒治療策略,可克服傳統(tǒng)腫瘤基因治療中轉(zhuǎn)染效率低、靶向性差、抗癌基因表達(dá)量低、殺傷力不夠等缺點(diǎn),因此,癌癥的靶向基因-病毒治療應(yīng)該會(huì)比過(guò)去的基因治療方法效果好很多。1pzd54基因靶向病毒載體有兩類:一類可以整合到染色體,如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒;另一類不能整合到染色體,如腺病毒、單純皰疹病毒及EB病毒。我們研究組使用最多的是腺病毒載體。構(gòu)建腫瘤特異增殖型病毒的方法很多。一種方法是將把病毒復(fù)制在正常細(xì)胞中所必需,而在腫瘤細(xì)胞中不需要的基因進(jìn)行剔除。腫瘤特異性增殖病毒ONYX-015正是遵循這個(gè)方法構(gòu)建的。腺病毒E1B55kd蛋白是腺病毒早期基因編碼的蛋白,能夠與細(xì)胞中的p53蛋白結(jié)合,抑制其功能。p53是宿主細(xì)胞抗腺病毒的主要蛋白,正常細(xì)胞受腺病毒感染后立即激活p53,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,腺病毒便不能再增殖,從而避免病毒擴(kuò)散到臨近組織,這是機(jī)體的一種“丟卒保車”的策略。由于腺病毒E1B55kd蛋白能夠抑制p53的功能,大多數(shù)正常細(xì)胞感染腺病毒后并沒(méi)有立即出現(xiàn)凋亡,腺病毒仍然能夠在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,因此E1B55kd蛋白是腺病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必需的。然而,p53途徑缺陷的腫瘤細(xì)胞中,病毒感染后,沒(méi)有p53可被激活,E1B55kd蛋白是“英雄無(wú)用武之地”。因此腺病毒缺失E1B55kd基因后,不能在正常細(xì)胞中復(fù)制,而能在p53失活的腫瘤細(xì)胞中大量復(fù)制、增殖,最終裂解腫瘤細(xì)胞,并釋放新的病毒去感染臨近的腫瘤細(xì)胞,以進(jìn)一步消滅腫瘤。我們研究組對(duì)野生型腺病毒基因組進(jìn)行改造,缺失其E1B55kd蛋白,但保留了腺病毒的E1A基因及E1B19kd基因,構(gòu)建了能靶向于p53功能缺失腫瘤細(xì)胞的腺病毒載體,命名為pZD55,它被同源重組為病毒后則命名為ZD55。我們構(gòu)建了與ONYX-015相似的pZD55,但構(gòu)建的方法簡(jiǎn)便,除只用Ad5而不用Ad2/Ad5融合病毒外,還能插入外源基因,構(gòu)成靶向基因病毒ZD55-gene,而ONYX-015則沒(méi)有該優(yōu)勢(shì)。構(gòu)建腫瘤特異性增殖病毒的另一種方法是利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒復(fù)制所必需的基因,如E1A、E1B,使這些基因只能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá),而在正常細(xì)胞中不表達(dá),從而使病毒只能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、增殖。腺病毒E1A基因是腺病毒感染細(xì)胞后最早表達(dá)的基因,是病毒復(fù)制所必需的。因此使用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制E1A基因的表達(dá),就能達(dá)到控制病毒復(fù)制的目的。目前,許多組織特異性啟動(dòng)子已被用來(lái)構(gòu)建腫瘤特異性增殖腺病毒,例如AFP啟動(dòng)子用于肝癌、PSA用于前列腺癌、MUC1啟動(dòng)子用于乳腺癌等,均取得了一定效果(詳見(jiàn)表1)。但這些啟動(dòng)子均具有腫瘤類型局限性,只能在該種組織來(lái)源的腫瘤中起作用。因此選擇更廣泛的腫瘤啟動(dòng)子,也是構(gòu)建腫瘤增殖腺病毒的一個(gè)方向。近年研究表明,端粒在細(xì)胞永生化和腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。人的端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT(humantelomerasereversetranscriptase)是端粒酶復(fù)合物的核心成分,可能是迄今發(fā)現(xiàn)的一個(gè)最為廣泛的腫瘤新標(biāo)志物。在生理?xiàng)l件下,正常人細(xì)胞大都沒(méi)有hTERT活性;而在85%～90%左右的人腫瘤細(xì)胞中hTERT活性高,并且其活性高低與腫瘤的惡性程度相關(guān),提示端粒酶可以作為腫瘤治療的很好的靶點(diǎn)。hTERT表達(dá)狀態(tài)與端粒酶活性顯著相關(guān),是細(xì)胞調(diào)控端粒酶活性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。hTERT基因的表達(dá)主要是從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié),在85%～90%左右的腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄上調(diào),而在靜息期細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄。因此,hTERT啟動(dòng)子被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼克隆出來(lái),并且用來(lái)控制外源基因的表達(dá)。hTERT啟動(dòng)子能夠使外源基因的表達(dá)限制在腫瘤細(xì)胞中,因此我們組用hTERT啟動(dòng)子取代E1A基因自身的啟動(dòng)子,構(gòu)建了一個(gè)新的腫瘤特異性增殖腺病毒,命名為Ad.TERT。我們的研究表明,Ad.TERT能夠使E1A基因在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá),而在正常細(xì)胞中不表達(dá),使Ad.TERT在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制、增殖,進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,Ad.TERT至少能夠在兩種不同組織來(lái)源的腫瘤動(dòng)物模型中顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng),這是利用腫瘤中TERT活性高而構(gòu)建腫瘤特異性增殖病毒的首次報(bào)道。我們構(gòu)建的病毒具有良好的殺腫瘤能力,而端粒酶活性升高是一個(gè)廣泛的腫瘤標(biāo)志物,以上類推,用腫瘤特異性的啟動(dòng)子控制E1A或E1B為腫瘤治療提供了一個(gè)平臺(tái)。Ad.TERT的作用還只是一個(gè)病毒治療,如在Ad.TERT中加入一個(gè)抗癌基因,則可以成為基因病毒治療。2抗癌基因的作用腫瘤的靶向基因-病毒治療:一方面要求病毒載體本身能特異在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,從而靶向地殺死腫瘤細(xì)胞。我們的ZD55及Ad.TERT系統(tǒng)即如此,如在其中再加入各種抗癌基因,就構(gòu)建成ZD55-gene及Ad.TERT-gene。ZD55-gene及Ad.TERT-gene在正常細(xì)胞中比在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力顯著降低,在正常細(xì)胞NHLF中下降為1/600倍,而在正常細(xì)胞MRC5中,直至下降為原來(lái)的1/1000倍。腫瘤的基因-病毒治療另一方面是它所攜帶的外源基因的表達(dá)量能隨病毒的復(fù)制和增殖而大大提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,基因的表達(dá)量隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而大大增加。由此可見(jiàn),ZD55-gene及Ad.TERT-gene系統(tǒng)能夠滿足腫瘤基因-病毒治療,既能滿足靶向性又能滿足抗癌基因的數(shù)量要求。在ZD55及Ad.TERT系統(tǒng)中加入相應(yīng)的抗癌基因,就創(chuàng)造了許多癌癥的靶向基因-病毒治療策略。可用的抗癌基因有:①促細(xì)胞凋亡基因Trail(tumornecrosisfactorrelatedapoptosisinducingligand),它只殺死腫瘤細(xì)胞,而非正常細(xì)胞;②解除細(xì)胞凋亡抑制蛋白的Smac(secondmitochondriaderivedactivatorofcaspase)基因;③抑癌基因p53;④調(diào)節(jié)免疫的基因IL-2、IL-12、IL-24;⑤血管生成抑素基因angiostatin、k5、VEGI、sFLT1;⑥自殺基因cd、tk;⑦抗自由基的基因MnSOD等(見(jiàn)表2)。我們組已將上述許多抗癌基因加入ZD55及Ad.TERT系統(tǒng)中,其療效均高于ONYX-015或ZD55或Ad.TERT。3兩個(gè)基因可能會(huì)對(duì)sw620的協(xié)同效應(yīng)或互補(bǔ)作用利用上述靶向基因-病毒治療癌癥,在個(gè)別情況下也能觀察到移植腫瘤被全部消滅的情況,但還不能達(dá)到將所有治療小鼠的移植腫瘤全部都消滅掉的療效。為了強(qiáng)化上述基因-病毒治療策略,我們又提出了雙基因-病毒治療策略(targetingdualgene-virotherapy),即在靶向載體ZD55或Ad.TERT中插入兩個(gè)基因后,兩個(gè)基因可能具有協(xié)同效應(yīng)或互補(bǔ)作用,這樣可加強(qiáng)它的抗癌功能。我們使用了ZD55-Trail與Ad-K5相結(jié)合,把SW620誘導(dǎo)的移植腸癌全部消滅。這是因?yàn)門(mén)rail能誘導(dǎo)SW620的凋亡,而K5能抑制腫瘤新生血管的生成,兩個(gè)基因從兩個(gè)不同方面,互補(bǔ)攻擊腫瘤,故能把所有小鼠長(zhǎng)到了100mm3的移植腫瘤全部消滅。我們也選用了ZD55-Trail與ZD55-Smac相結(jié)合,結(jié)果把治療組中所有小鼠皮下由Bel7404誘導(dǎo)的移植肝癌全部殺滅了。肝癌(HCC)對(duì)Trail不敏感,因?yàn)楦伟┲泻休^高抑制凋亡的蛋白質(zhì)(IAP),故Trail較難啟動(dòng)肝癌細(xì)胞的凋亡,而Smac能消除IAP的作用,故Smac能使Trail對(duì)肝癌產(chǎn)生較好的凋亡作用,而Trail作用后又能誘導(dǎo)Smac的產(chǎn)生,故二者有協(xié)同效應(yīng),共同殺傷腫瘤,能把腫瘤全部消滅。此法也可能作為治療高IAP含量的腫瘤的一個(gè)平臺(tái)。從我們獲得的好結(jié)果說(shuō)明,雙基因病毒治療策略是一個(gè)目前已知的不需用化療輔助就可將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤全部消滅的最好生物治療方案之一。4雙靶向載體的概念及其在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用一個(gè)好的腫瘤靶向載體系統(tǒng),應(yīng)具有靶向遍布病人全身腫瘤細(xì)胞的能力,同時(shí)又要減少對(duì)正常細(xì)胞的潛在毒性。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,ZD55及Ad.TERT載體有很好的腫瘤靶向性,對(duì)正常細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性很小。多個(gè)臨床中心對(duì)ONYX-015進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也證實(shí)它在人體應(yīng)用是安全的,但在選擇增殖性病毒時(shí),該病毒的靶向性應(yīng)被高度重視。為此,我們?cè)赯D55及Ad.TERT單靶向載體的基礎(chǔ)上又提出了雙靶向病毒載體的概念:即用不同的腫瘤特異性啟動(dòng)子分別控制病毒復(fù)制所必需的不同基因,使病毒載體更特異地靶向腫瘤細(xì)胞。根據(jù)此概念,我們將ZD55與Ad.TERT兩個(gè)靶向載體組合起來(lái),構(gòu)成雙靶向載體。另根據(jù)雙基因可以完全消滅腫瘤,我們采用了雙靶向載體又帶雙基因的策略。我們有各種基因可以選擇(表2),也有各種靶向載體可以選擇(表1),如TERT-HRE(缺氧誘導(dǎo)因子的結(jié)合元件)-Trail/Smac或-Trail/K5,hTERT-AFP-肝癌抑制基因-IL-24或TERT-PSA-Trail/K5等等,這樣應(yīng)該會(huì)有效果很好的藥品用于臨床試驗(yàn)和治療。5無(wú)腸腺病毒的基因表達(dá)以上所述的載體都是改造過(guò)的腺病毒,具有一定的抗原性,故易被其抗體所清除,而不能保持長(zhǎng)期效果。另一方面,由于腺病毒有一定的包裝容量限制,不能加入很長(zhǎng)的基因,總大小不能超過(guò)了38kb,否則就無(wú)法包裝出病毒。因此,我們又在研究使用第三代腺病毒,即無(wú)腸(Gutless)腺病毒,對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行可調(diào)控的靶向治療研究。在無(wú)腸腺病毒中,其內(nèi)部所有的基因都已被全部刪除。使用該病毒具有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):①可裝入很大的外源基因;(2)無(wú)抗原性,故不易被其抗體清除,可長(zhǎng)期使用。錢(qián)程等已將無(wú)腸腺病毒應(yīng)用于對(duì)惡性腫瘤的治療研究。我們構(gòu)建的無(wú)腸腺病毒(GL-Ad)含有至少兩個(gè)表達(dá)盒。表達(dá)盒-1:反式作用元件(trans-activator,TA)表達(dá)盒。該表達(dá)盒的構(gòu)成是:(1)腫瘤組織特異性啟動(dòng)子;(2)反式作用元件(trans-activator,TA)(包括:源于酵母的GAL4因子DNA結(jié)合片段、突變的孕酮受體基因片段、核因子NF-kB的p65亞基基因片段)。表達(dá)盒-2:抗癌基因表達(dá)盒。含17-merx4GAL4上游序列TATA盒以及多克隆位點(diǎn)MSC。我們運(yùn)用雙基因理論,則可構(gòu)建可調(diào)控的雙靶向雙基因的無(wú)腸腺病毒(既有雙靶向,又用雙基因,還是可調(diào)控的,需要時(shí)基因就表達(dá),不要時(shí)則關(guān)閉,基因不表達(dá))。如圖1所示的攜帶Smac和Tra