泥同工酶的結(jié)構(gòu)和表達分析

泥同工酶的結(jié)構(gòu)和表達分析

1泥基因表達的選擇性研究它通常被稱為血卟、粒蟲、花混合物。這是雅維諾科的一個分支。分布在內(nèi)灣海灘，有淡水、平坦、水流順暢的沼澤。它生活在洞穴里。它是一個重要的經(jīng)濟魚類。由于其豐富的營養(yǎng)成分和優(yōu)美的口感，它深受人們的喜愛。目前，這項研究主要集中在組織、繁殖技術(shù)和種子栽培上，對生化遺傳的研究較少。于子牛等人研究了五種組織中的不同異質(zhì)酶，但不同組織的表型沒有太大的不同。在本研究中，采用聚吡咯電泳法對五種組織中的19種同工酶進行檢測和分析，以了解不同組織的遺傳特征。為探索貝類研究提供了一些理論參考，并對其他組織的遺傳特征、物種識別和生物進化進行了研究。2材料和方法2.1組織的解剖泥蚶樣本取自浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所.泥蚶殼長度為2.2～2.7cm,把活體帶回實驗室,取其中的15～20個個體立即解剖,取外套膜、閉殼肌、足、鰓、消化腺等5種組織,-70℃低溫冰箱保存.2.2方法2.2.1離心酶提取法將準確稱取的5種組織,蒸餾水漂洗后,以1∶3的比例(體重與體積之比)加入0.05%巰基乙醇,冰浴下勻漿,4℃冷凍離心機中12000r/min離心30min(消化腺離心2次或更多次,直至提取的酶液純清)取上清,加入適量溴酚蘭后分裝,樣品放入-70℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?2.2.2電泳酶類及有關(guān)系統(tǒng)采用不連續(xù)垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳法.分離膠濃度為8.2%(pH8.9),濃縮膠濃度為3.6%(pH6.7),電泳在4℃冰箱中進行.TG系統(tǒng)恒壓230V,TC系統(tǒng)恒壓80V,EBT系統(tǒng)恒壓140V,電泳時間為5～6h.實驗所測酶類及有關(guān)系統(tǒng)見表1.同工酶的顯色方法均見參考文獻本文略作改動.染色完畢后用7.5%冰醋酸溶液固定,生物電泳圖像系統(tǒng)進行攝影記錄.電泳酶譜分析見參考文獻.2.2.3酶譜帶鑒定以各種酶譜的相對遷移率Rf由小到大依次命名,即向陽極運動的酶譜帶開始依次命名為1,2,3,…Rf=l/L,l為陰極端至各譜帶中點的距離,L為陰極端至指示劑終點的距離.3酶類活性鑒定本實驗共檢測了19種同工酶,如表1所示.其中過氧化氫酶、甲酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、D-葡萄糖脫氫酶等4種酶未顯示任何有活性的區(qū)帶,磷酸-6-葡萄糖脫氫酶和谷氨酸脫氫酶只顯示很微弱且不穩(wěn)定的區(qū)帶,α-淀粉酶、酸性磷酸酶只在消化腺中存在有明顯的譜帶,而其他種酶類則在各個組織中都顯示出清晰穩(wěn)定的圖譜(見圖1,2).3.1表面活性劑mdh的抗氧化酶活性MDH是細胞中三羧酸循環(huán)中重要的脫氫酶之一,三羧酸循環(huán)對于任何一機體都起著重要的作用.由圖1可見,泥蚶的蘋果酸脫氫酶分布較廣,在5種組織中均存在較強的活性區(qū)帶,即MDH-1,2,3,4,5,6,但不同組織譜帶相對活性存在明顯不同,MDH在閉殼肌、足中的染色最深,這與肌肉收縮需要大量能量,在檸檬酸循環(huán)過程中MDH把蘋果酸轉(zhuǎn)為草酰乙酸有關(guān).3.2me的活性分類泥蚶的蘋果酸酶存在2～4條譜帶,其中ME-1和4在各個組織中都存在,而ME-2,3只存在于足、閉殼肌組織和消化腺中,泥蚶各組織中的蘋果酸酶不僅存在譜帶數(shù)的差異,在活性上也存在較明顯的差別,但不管是數(shù)量上還是活性上消化腺中的蘋果酸酶的表達都是占優(yōu)勢的,其次是足組織.魚類的ME可分為細胞質(zhì)型(s-ME)和線粒體型(m-ME),其中m-ME由一個基因位點編碼,為四聚體產(chǎn)物,在電泳圖譜上遷移較慢;s-ME也只有一個基因位點編碼,本研究揭示泥蚶的ME與魚類一樣,也有s-ME和m-ME,但在酶譜上與魚類略有差異.3.3消化腺的代謝活性泥蚶的酯酶表型較復(fù)雜,有13條酶帶明顯分為5個區(qū)域,各組織有5～12條酶帶,其中EST-1,2,5僅存在于鰓和消化腺中,EST-3只存在于鰓組織,而EST-6只存在于外套膜、鰓和消化腺中,EST-7,8,9也僅在消化腺中表達.從圖1可見消化腺的酯酶最復(fù)雜有12條帶,而且表現(xiàn)出的酶活性也最強,這與酯酶的生理功能是一致的.EST是催化酯類化合物水解并進入中間代謝的重要酶類,其作用除維持細胞正常的能量代謝外,還能水解大量非生理正常存在的酯類化合物,被認為可能與機體的解毒作用密切相關(guān).消化腺是泥蚶重要的消化器官,同時也是機體最重要的解毒器官,泥蚶中EST-7,8,9酶帶僅存于消化腺中,因而可能與解毒的代謝活動有關(guān).3.4sod的分布SOD酶譜較簡單,各組織均表現(xiàn)出4條酶帶,但在活性上略有差別,其中閉殼肌和消化腺中的SOD較其他組織略強.SOD是生物體防御氧化損傷的重要酶類,當生物體受到外界病原體侵染后,體內(nèi)自由基濃度將升高,而SOD能清除體內(nèi)過多的自由基,以免除其對自身細胞的毒害.消化腺是較易受到外界病原體侵害或不利因素影響的組織,這恰與消化腺中SOD同工酶活性高于其他組織相適應(yīng).另外一般認為SOD有兩個座位控制,分二聚體的s-SOD(上清液型)和四聚體的m-SOD(線粒體型)兩類,在相同的電泳條件下,s-SOD因是可溶性的,從而在上清液中酶含量較高而易于檢測出來,且遷移較快;而m-SOD常因難溶于上清液中使上清液中酶含量較低而難檢測出.結(jié)合以上特征,本研究的SOD所得的譜帶很可能是s-SOD,至于其位點控制情況還有待于進一步探討.3.5帶數(shù)量和活性泥蚶的乳酸脫氫酶的活性較弱,表現(xiàn)為兩條酶帶,酶帶數(shù)量上各組織間無顯著差異,其中LDH-1很微弱,LDH-2則較強.在活性上足組織表達較強,這可能與足肌纖維收縮時需要大量的能量供應(yīng)有關(guān).3.6pod的表達泥蚶的過氧化物酶各組織有3～5條帶,明顯的分為4個區(qū)域.其中POD-3,5僅存在于消化腺中,在酶的表達活性上消化腺表達略強.植物的POD一般被認為是由一個位點控制的單體或二聚體酶;魚類POD的亞基組成尚未清楚.從已有的研究結(jié)果來看,有的魚類POD被認為是二聚體酶,有的則認為是單體酶,還有的認為是四聚體酶.對于泥蚶POD的位點控制情況及其亞基組成情況怎樣還有待于進一步研究.3.7魚類idh的活性泥蚶的異檸檬酸脫氫酶有4條區(qū)帶,其中m-IDH-1較容易失活,儲存較長時間的樣品不宜檢測到,有關(guān)IDH同工酶部分酶帶失活的現(xiàn)象在其他生物體中也有過類似報道.在IDH譜帶上各組織無顯著差異,僅活性上略有差別.一般魚類IDH分為細胞質(zhì)型(s-IDH)和線粒體型(m-IDH),m-IDH由一個基因位點編碼,在電泳圖譜上表型為1條帶,遷移慢;s-IDH由兩個基因位點編碼,表型為3條帶,遷移快.泥蚶的IDH酶譜表型上與之相似,但結(jié)合泥蚶的居群分析資料(將另文發(fā)表)表明,泥蚶的IDH同工酶實際是受兩個位點控制的,IDH-2,3,4三條酶帶是一個位點的雜合形式,這與姜建國等對草魚同工酶的研究結(jié)果相似.3.8泥和魚類的adh活性差異泥蚶的醇脫氫酶相對簡單,只有兩條靠的非常近的區(qū)帶,各組織間沒有顯著差異,在活性上也只有足組織稍微低一點.一般來講魚類的ADH是由一個基因位點編碼的二聚體,由兩個基因位點編碼的二聚體酶的情形也有報道.從本研究來看泥蚶的ADH酶譜與后者相類似.3.9泥消化腺消化腺泥蚶的淀粉酶只在消化腺中有所表達,在其他各組織中均無表達活性,呈兩條白色帶,而未見粉紅、紅褐色等有色條帶.淀粉酶的這種分布與泥蚶消化腺所擔負的生理功能是相一致的.泥蚶是濾食性貝類,以各種藻類為生,因此消化腺中存在的高強度的淀粉酶也是其消化器官對食物中存在著的淀粉物質(zhì)的一種適應(yīng).3.10酶帶的檢測泥蚶的山梨醇脫氫酶比較簡單,只存在1條酶帶.在5種組織中只有足不顯示任何有活性的區(qū)帶,而在其他組織中都有較強的酶帶.目前對于山梨醇脫氫酶的生理功能等方面的研究還不多,因此泥蚶的足組織為何無此酶活性還有待于進一步研究.3.11酸性磷酸酶的測定泥蚶的酸性磷酸酶的表達與淀粉酶相似,只在消化腺中有明顯的條帶,而在其他組織中均不表達.酸性磷酸酶是一種在酸性條件下水解各種磷酸酯的酶,動物的消化腺是主管食物降解消化吸收的地方,因此消化腺中需要大量的酸性磷酸酶的存在,是對消化腺生理功能的適應(yīng).3.12琥珀酸脫氫酶scd，e.c.1.3.99.1泥蚶的琥珀酸脫氫酶在各組織中表達較一致,都為1條酶帶,而且遷移率相同,在表達活性上也沒有顯著差異.3.13水生動物酶alp的酶學(xué)研究泥蚶的堿性磷酸酶相對較簡單,只有1條酶帶,各組織之間無顯著差異,只在活性上略有不同.目前對于水生生物的ALP研究較少.有資料表明魚類和貝類的ALP可能是由兩個基因位點編碼的單聚體和二聚體酶.本研究只發(fā)現(xiàn)了1條酶帶,因此推測泥蚶的ALP是由一個基因位點編碼的單聚體或二聚體酶.4泥體內(nèi)的同工酶(1)從以上結(jié)果可以看出,在泥蚶的5種組織中已存在相當豐富和完整的酶系統(tǒng),它們不僅以同工酶的形式參與代謝和調(diào)節(jié),而且在表型、分布和活性上均表現(xiàn)出高度的組織特異性.從檢測到的有穩(wěn)定基因表達的13種酶的種類來看,幾乎涵蓋了所有脊椎動物體中所存在的常見的同工酶種類,所涉及的代謝途徑也與高等動物的相類似.說明泥蚶已具備了與高等動物相類似的機體代謝方式.從這些酶的分布來看,許多酶都表現(xiàn)出了組織分布的“不均勻性”,這種不均勻性不僅與各組織的不同生理分工相一致,如淀粉酶只存在消化腺中.EST在消化腺中表達最強,LDH在足中活性最高等,而且也與機體對自身基因表達進行調(diào)控相聯(lián)系.(2)在所檢測的19種同工酶系統(tǒng)中,過氧化氫酶、甲酸脫氫酶、半乳糖脫氫酶、D-葡糖脫氫酶等4種酶未見表達,其中過氧化氫酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化防御性功能酶,與機體的免疫機能密切相關(guān),因而與SOD一起作為生物體的保護系統(tǒng)而被廣泛地研究.目前已在許多種動物體內(nèi)檢測到了CAT活性的存在,包括一些重要的魚類和經(jīng)濟貝類,但本研究雖然檢測到了較強活性的SOD同工酶,但未見CAT同工酶的表達,這是否說明泥蚶體內(nèi)確實不存在這種酶系統(tǒng)或該酶的濃度低于檢出值,還是說明所選的凝膠系統(tǒng)不合適,或是本身酶系統(tǒng)容易失活而未能檢出還有待于今后的研究,但從以往的研究來看,在幾種機體防御性同工酶中,動物體缺少其中的一種或兩種同工酶的現(xiàn)象也是很正常的.至于D-葡糖脫氫酶、甲酸脫氫酶及半乳糖脫氫酶的研究目前在水生生物上報道較少,尤其在貝類上未見相關(guān)報道.筆者們對這3種同工酶作了嘗試,但均未見酶的表達活性.另外,磷酸-6-葡萄糖脫氫酶和谷氨酸脫氫酶也是參與機體代謝的非常重要的兩種酶類,這兩種酶在魚類及其他高等動物中普遍存在.其中磷酸-6-葡萄糖脫氫酶是糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶,而該途徑與生物體內(nèi)脂肪酸、固醇類物質(zhì)的合成及核酸代謝均有著密切的關(guān)系.谷氨酸脫氫酶是催化體內(nèi)氨基酸氧化脫氨基作用的酶之一,它的活性與蛋白質(zhì)合成與分解有著直接的關(guān)系,在泥蚶中這兩種酶表達的都很弱或不穩(wěn)定,這說明泥蚶體內(nèi)這兩種同工酶所控制的代謝活動的水平都較低.當然也不排除另外一種可能,即在采集樣品的時侯泥蚶所處的生理狀態(tài)正好是這兩種酶所參與的代謝途徑處于水平較低的時候,當然,要作出正確判斷還需結(jié)合不同發(fā)育時期泥蚶的同工酶表達資料.另外,ADH也是一種重要的酶類,它的生理作用是適應(yīng)厭氧酵解的需要.該酶的活性較大,在氧氣供應(yīng)不足的情況下,就不會造成因缺氧三羧酸循環(huán)受到阻礙,導(dǎo)致丙酮酸的過量積累而使動物中毒死亡.在泥蚶中ADH的活性相當高且很穩(wěn)定,它和LDH一起使得泥蚶能夠適應(yīng)低氧的泥棲生活.但這與對馬氏珠母貝、合浦珠母貝、大珠母貝及三角帆蚌的研究結(jié)果不一樣,這些貝類中ADH的活性很弱或根本無活性,這是否說明泥蚶比它們更適應(yīng)水環(huán)境生活還有待于進一步研究.(3)在同工酶表型和基因座位上,泥蚶與高等脊椎動物有著相似的遺傳性狀,如前所述ADH,IDH等.但泥蚶作為在分類階元上較低等的貝類,其同工酶表型又表現(xiàn)出與之分類地位相一致的特征,LDH是一種適應(yīng)厭氧呼吸的一種酶類被廣泛用于生物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)分類、進化理論和種群遺傳分析等研究領(lǐng)域.在魚類、鳥類、哺乳類中LDH均由A,B,C3個基因編碼,其中A,B兩個位點產(chǎn)物在多數(shù)組織中存在,而C位點表達具有組織特異性.因此在一般組織中就會形成典型的5條酶帶表型,而泥蚶的LDH則較簡單,只顯示兩條酶帶,其中1條較強,1條較弱,反應(yīng)出其較低等的一面.但同時LDH的這種表型在貝類中也是少見的,與喻子牛等對魁蚶及李廣麗等對馬氏珠母貝和合浦珠母貝的研究結(jié)果不同,也不同于邵健忠等對三角帆蚌的研究,即LDH只有1條酶帶,由一個位點LDH-A控制,從而表現(xiàn)出其較特殊的一面.邵健忠等認為LDH只有到了魚類這個階段才出現(xiàn)了B基因,在軟體動物中還未出現(xiàn),本研究中泥蚶的LDH出現(xiàn)了兩條帶,對應(yīng)