單元四：重組蛋白的分離純化及檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告題目:單元四:重組蛋白的分離純化及檢測(cè)指導(dǎo)老師:王磊日期:2013/11/7-201311/9一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)習(xí)親和層析的原理；2、掌握親和層析法分離蛋白質(zhì)的技術(shù)與操作；3、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的技術(shù)和原理；4、掌握SDS分離蛋白質(zhì)組分的操作方法；5、了解Westernblotting的原理及其意義，掌握Westernblotting的操作方法；6、應(yīng)用Westernblotting技術(shù)分析鑒定經(jīng)SDS分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的重組蛋白。實(shí)驗(yàn)原理：(1)親和層析：以普通凝膠作載體，連接上金屬離子制成螯合吸附劑，用于分離純化蛋白質(zhì)，這種方法稱(chēng)為金屬螯合親和層析。蛋白質(zhì)對(duì)金屬離子具有親和力是這種方法的理論依據(jù)。已知蛋白質(zhì)中的組氨酸和半胱氨酸殘基在接近中性的水溶液中能與鎳或銅離子形成比較穩(wěn)定的絡(luò)合物，因此，連接上鎳或銅離子的載體凝膠可以選擇性地吸附含咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。過(guò)渡金屬元素鎳在較低pH范圍時(shí)（pH6-8），有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。在堿性pH時(shí)吸附更有效，但選擇性降低。金屬螯合親和層析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。本實(shí)驗(yàn)用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)GFPuv是和6His融和表達(dá)的，含有特定的組氨酸標(biāo)簽，這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離，且操作簡(jiǎn)單，快速，純化效率高。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)：由丙稀酰胺單體（acrylamide)和交聯(lián)試劑N，N’－甲叉雙丙稀酰胺（N,N-methylenebisacrylamide)在催化劑存在的情況下聚合而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，改變單體的濃度與交聯(lián)劑的比例，可以得到不同孔徑大小的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：①化學(xué)聚合－催化劑采用過(guò)硫酸銨，加速劑為N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），通?？刂七@兩種溶液的用量使聚合在1h內(nèi)完成；②光聚合－催化劑：核黃素，通過(guò)控制光照時(shí)間和強(qiáng)度可控制聚合時(shí)間。聚丙烯酰胺凝膠電泳常分為兩大類(lèi)，一是連續(xù)電泳：使用相同孔徑的凝膠和相同緩沖系統(tǒng)的樣品緩沖液、凝膠緩沖液和電極緩沖液，pH值恒定，只是離子強(qiáng)度不同，具有電荷和分子篩效應(yīng)；二是不連續(xù)電泳：使用不同孔徑凝膠和不同緩沖系統(tǒng)的電泳，具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和濃縮效應(yīng)，分離效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis)，一種陰離子表面活性劑，以一定比例與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種SDS－蛋白質(zhì)復(fù)合物，帶有大量負(fù)電荷，降低乃至消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷差別。SDS和強(qiáng)還原劑的作用，可以使分子解聚，結(jié)構(gòu)松散，形狀趨于一致。電泳遷移率的差別僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)聚合法制膠，進(jìn)行不連續(xù)電泳，并用考馬斯亮藍(lán)快速染色，以分離和鑒定純化的蛋白產(chǎn)物。（3）westernblot：蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS電泳后，凝膠所含的樣品蛋白質(zhì)區(qū)帶通過(guò)電泳方法轉(zhuǎn)移、固定到載體（如尼龍膜、硝酸纖維素膜、PVDF膜）上；然后以膜上的蛋白或多肽為抗原，與相應(yīng)的第一抗體和酶標(biāo)記的第二抗體反應(yīng)，用適當(dāng)?shù)娜芤浩慈ノ唇Y(jié)合抗體后，置含底物的溶液中培育，顯出譜帶，即可檢測(cè)出樣品中的特異組分。三．材料和試劑材料：重組pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白；Ni2＋chelatingSepharoseFastFlow填料及層析柱。試劑：(1)蛋白純化所需試劑（溶液1－3全班共用）1、1.5M咪唑（MW68.08溶液全班共500ml(1組配置））2、0.5MEDTA溶液用NaOH調(diào)pH8.0，全班共300ml（2組配置）3、20％乙醇溶液全班共1000ml（8組配置）（以下溶液每組配一份，可用母液稀釋?zhuān)?、超聲和平衡緩沖液：50mMTris-HCl,500mMNaCl,pH7.0500mL5、洗脫液I：50mM咪唑,50mMTris-HCl,500mMNaCl,pH7.0，75mL6、洗脫液II：300mM咪唑(MW68.08),50mMTris-HCl,500mMNaCl,pH7.0，50mL7、0.2MNiSO4?6H2O(MW:262.85)溶液50ml8、0.05MEDTA,0.5MNaCl溶液100ml9、1MNaOH溶液100ml溶液5、6、8可在過(guò)柱前直接用母液稀釋配置(2)蛋白質(zhì)電泳所需試劑：(全班分兩大組，每組配一份，1－7組一份，8－14組一份)①30%的凝膠貯備液:（1/8組各配300ml)Acr29g+Bis1g溶于100mL去離子水中。避光貯存棕色瓶中，4℃保存②3MTris-HCl(pH8.9):（配100mL）（2/9組各配300ml)36.6gTris-base+48mL1MHCl（或約4.5mL濃鹽酸）+ddH2O至100mL③5×Tris-甘氨酸電泳buffer（pH8.3):（配2.5L）(3/10組配置）Tris-base15.1g+甘氨酸94g+5gSDS+H2O至1L（用時(shí)稀釋5倍）。④10%SDS：1gSDS溶解于10mL去離子水中，貯存于室溫中。(4/11組各配20ml）⑤0.5MTris-HCl(pH6.8):（配250mL）（5/12組配置）6.05gTris-base+48mL1MHCl（或約4.5mL濃鹽酸）+ddH2O至100mL⑥10%AP(過(guò)硫酸銨):(共用)1gAP溶解于10mL去離子水中，新鮮配制。（6組分裝到6個(gè)EP管）⑦TEMED(四甲基乙二胺):(共用，9組分裝到1.5mlEP管中)⑧5x樣品緩沖液：(7、14組配置)0.3MTris-HCl(pH6.8)濃縮膠緩沖液8.5ml50%甘油8.0ml10%SDS8.0ml0.1%（w/v)溴酚藍(lán)10mlβ-巰基乙醇2.0ml加重蒸水至總體積40ml⑨考馬斯亮藍(lán)染色液R250（可重復(fù)使用）：（8/15組各配置200ml）0.25g考馬斯亮藍(lán)溶于45mL甲醇中，加10mL冰醋酸+H2O至100mL。（濾紙過(guò)濾除去不溶物）⑩脫色液：（8/15組各配置3L）75mL冰乙酸+50mL甲醇+875mLH2O(3)Westernblot所需試劑：1.轉(zhuǎn)移緩沖液（Transferbuffer）：14.4g甘氨酸，30.725gTris（48mmol/L），1.875ml20%SDS溶液，150ml甲醇，定容至1L。（兩組配1L)2.

封閉液：5%脫脂奶粉，溶于TBST溶液中.(全班配置400ml）。3.

TBST洗膜液：TBS緩沖液含0.1%Tween-20；4.20xTBS:30.28gTris堿（50mM），43.83gNaCl用適量ddH2O溶解后，加入7.5ml濃HCl調(diào)節(jié)pH至7.5，定溶至250ml，TBS在2-8℃保存;器材層析柱，鐵架臺(tái)，軟管，夾子，垂直板電泳槽，搖床，電爐（全班一個(gè)），漂板（全班1－2個(gè)），紫外檢測(cè)儀、蠕動(dòng)泵、電腦顯示系統(tǒng)，SDS電泳裝置一套，電轉(zhuǎn)移膜裝置，抗體-酶反應(yīng)搖床，鎳親和層析凝膠的分裝（大約5－10ml/組），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收回。實(shí)驗(yàn)步驟、現(xiàn)象、結(jié)果及分析(1)蛋白質(zhì)親和層析實(shí)驗(yàn)步驟1、親和層析柱的填裝（裝柱）把層析柱固定在鐵支架上，上端的柱頭擰下，柱下端出口封閉。加入少量的去離子水，排去下端的空氣泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝膠5mL到燒杯中，加入少量的去離子水制成糊狀，沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi)，打開(kāi)下端的排水口，讓親和凝膠劑隨水流自然沉下。層析柱剩余部分加滿(mǎn)水，親和層析凝膠約為15mL。將上端的柱頭擰緊，并將頂端和下端用軟管連接封閉。2、層析系統(tǒng)的安裝、調(diào)試蠕動(dòng)泵的調(diào)試：打開(kāi)背后電源開(kāi)關(guān)，按下start按鈕，上下箭頭調(diào)節(jié)流速為20rpm（約2ml/min），將軟管充滿(mǎn)去離子水。將蠕動(dòng)泵的出水管與層析柱上端管相連，層析柱的下端管與紫外檢測(cè)儀的進(jìn)樣端連接，（進(jìn)行自動(dòng)收集時(shí)，將紫外的out端與自動(dòng)收集器相連）。打開(kāi)紫外背后開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)靈敏度旋鈕（ABS－Range）為0.5A，調(diào)節(jié)調(diào)零旋鈕打開(kāi)電腦桌面的“伍豪色譜工作站”，點(diǎn)擊左上角的圖標(biāo)，選擇B通道，三角代表開(kāi)始采樣，采樣結(jié)束時(shí)按四方形按鈕，載入B通道譜圖，保存結(jié)果，并打印。3、層析柱的預(yù)處理：用5X柱床體積去離子水約25ml清洗乙醇封存的Ni2＋－ChelatingSepharoseFastFlow親和層析柱，去除乙醇；用2X柱床體積約10ml的0.2MNiSO4過(guò)柱，用10X柱床體積的去離子水約50ml清洗，用5X柱床體積約25ml平衡緩沖液平衡柱子4、上樣、洗滌先從50mL裂解上清液中取出100μL于EP管準(zhǔn)備用于電泳，作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對(duì)照?qǐng)D譜。然后以每分鐘2mL（20rpm）的流速上層析柱，當(dāng)紫外吸收峰升高時(shí)，用三角瓶收集流出液，當(dāng)升值最高峰時(shí)，用EP管收集一管用作電泳。上樣完畢后，再用平衡緩沖液過(guò)層析柱，直到紫外吸收不再下降（達(dá)平臺(tái)期為止）。用含50mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗脫，收集紫外吸收峰，紫外吸收達(dá)最高時(shí)用EP管收集一管用于電泳。5、洗脫：用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫，同時(shí)啟動(dòng)自動(dòng)收集(120seconds收集一管），當(dāng)紫外吸收達(dá)最高峰時(shí)用EP管收集2管，用于電泳及下次的western－blotting實(shí)驗(yàn)。色譜分析報(bào)告如下圖一所示：圖一：色譜分析報(bào)告從上圖可以看出，7.6min和15.2min出現(xiàn)的兩個(gè)峰為雜蛋白峰，此時(shí)，目標(biāo)蛋白GFP被吸附在層析柱上，流出的蛋白為雜蛋白，30.4-38min間出現(xiàn)的峰為用含50mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗脫后收集蛋白時(shí)出現(xiàn)的峰，這些蛋白與層析柱結(jié)合能力較弱，可能會(huì)有少量GFP被洗脫，38-45.6min間出現(xiàn)的峰為用含300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫后收集GFP蛋白時(shí)出現(xiàn)的峰，因?yàn)镚FP蛋白與6×His蛋白融合表達(dá)，因而需用高濃度的咪唑才能洗脫。實(shí)驗(yàn)分析有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)中SDS和westernblot進(jìn)一步證實(shí)。6、層析柱的處理及封存用2X去離子水約10ml清洗柱子用5X體積約25ml1MNaCl，50mMEDTA(pH8.0)洗去結(jié)合的鎳離子用5X體積約25ml去離子水清洗柱子用5X體積約25ml1MNaOH洗柱洗柱，去殘留蛋白用大約10X去離子水清洗柱，去處NaOH,使pH值低于9用大約2X柱床體積約10ml乙醇過(guò)柱，拆除柱子，將層析填料用20％乙醇封存在50ml離心管中，放在4℃冰箱保存，注意不要損失柱料。(2)蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)步驟1、膠板模型的安裝（教師演示）：玻板固定在制膠架上2、12%分離膠的制備（每次配10mL）如下：去離子水3.2mL30%凝膠液4.0mL3mol/LTris-HCl(pH8.9)2.6mL10%SDS100uL10%AP100uLTEMED4ul取上述液體加入燒杯中，TEMED最后加入，用手輕搖混勻(注意不要產(chǎn)生氣泡），小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中(約2/3)，為濃縮膠留足夠的空間，輕輕在頂層加入幾毫升去離子水覆蓋，以阻止空氣中氧對(duì)聚合的抑制作用。剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面，將剩余的凝膠留在燒杯中，根據(jù)燒杯中的膠是否凝固來(lái)判斷分離膠是否凝好。濃縮膠的制備如下：去離子水3.2mL30%凝膠液0.83mL3mol/LTris-HCl(pH8.9)0.75mL10%SDS60uL10%AP50uLTEMED4ul先吸去已聚合好的分離膠上層的水，再用濾紙吸干殘留的水液。按上述配方制備5毫升濃縮膠溶液，混合后將其注入分離膠上端，插入梳子應(yīng)小心避免氣泡。4、在濃縮膠聚合的同時(shí)，將樣品與樣品緩沖液(5Xbuffer)按1：5比例混合，100℃加熱3分鐘以變性蛋白（電磁爐、鍋）。5、濃縮膠聚合完全后，小心地拔出梳子，用去離子水沖洗梳孔，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入1X電泳緩沖液，檢查有無(wú)漏液，除去兩玻璃板間凝膠底部的氣泡，上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。6、按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，15μL/孔，一孔加一個(gè)樣品，同時(shí)安排已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作對(duì)照。7、電泳：開(kāi)始時(shí)濃縮膠電壓為100V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增到150V，繼續(xù)電泳至染料（溴酚藍(lán)）到分離膠底部，斷開(kāi)電源。8、固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考馬斯亮藍(lán)染色液固定并染色，放在搖床緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)10min左右。9、脫色：先用水洗去染料，再放入脫色液中浸泡，更換脫色液4次，脫色過(guò)夜。10、將脫色后的凝膠拍照，結(jié)果如下圖二所示：Marker1234567KD1701309572554334261710圖二：SDS結(jié)果，點(diǎn)樣樣品包括：蛋白Marker，1：pGFP未誘導(dǎo)總蛋白（2#），2：pGFP加Glu及IPTG誘導(dǎo)總蛋白（3#），3：pGFP加IPTG誘導(dǎo)總蛋白（4#），4：離心上清(可溶蛋白)，5：層析時(shí)的穿流峰（雜蛋白），6：層析時(shí)的50mM咪唑洗脫峰，7：層析時(shí)的300mM咪唑洗脫峰(純化的pGFP)。從上圖可以看出，marker條帶位于最左端，marker泳道中10KD和17KD兩條帶幾乎重合，但還是可以看出上面的藍(lán)色及下方的綠色條帶；7號(hào)泳道GFP條帶最深最寬，位于26-34KD左右，該結(jié)果與其約27KD的分子量相符，其條帶又深又寬，與其經(jīng)過(guò)300mM咪唑洗脫純化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程相符；6號(hào)泳道為經(jīng)50mM咪唑洗脫，可以看出許多其他條帶及隱約的一條GFP條帶，證明有少量GFP被洗脫；5號(hào)泳道為雜蛋白，為層析時(shí)的穿流峰，含有許多不同分子量的條帶，但不含GFP；4號(hào)泳道為離心上清，由于超破后離心，上清中含有許多蛋白，包括GFP，因而電泳結(jié)果中不僅含雜蛋白，也含GFP；1、2、3號(hào)泳道分別為重組大腸桿菌GFP的本底水平表達(dá)、葡萄糖降解物阻遏效應(yīng)后的表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)，因而只有3號(hào)泳道有GFP的出現(xiàn)，當(dāng)然，1、2、3號(hào)泳道還有其他雜蛋白的表達(dá)，上圖中可以看出幾條隱約出現(xiàn)的細(xì)細(xì)的條帶。圖二證實(shí)了圖一的分析。（3）westernblot實(shí)驗(yàn)步驟①電轉(zhuǎn)移1．將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS，待溴酚藍(lán)跑出膠后停止電泳。2．戴手套切4張定性濾紙和一張PVDF膜，大小應(yīng)與凝膠的大小相同。在膜的一（左）角作一記號(hào)（剪角），用鉛筆在膜的一角做標(biāo)記。將PVDF膜浸入100％甲醇10秒，然后與濾紙和海綿（纖維）墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中。剝膠，并將凝膠裁成合適大小，切角以做記號(hào)。次序：負(fù)極（黑孔板）－>纖維墊->2張濾紙->凝膠->PVDF膜->2張濾紙->纖維墊->正極板（紅孔板）－>扣上吊扣－>插進(jìn)轉(zhuǎn)膜槽中－>置于冰盒中。按下列意圖，接上電源（凝膠一邊接負(fù)極，PVDF膜一邊接正極），恒流400mA電泳2小時(shí)后關(guān)閉電源，將膜取出，然后用蒸餾水清洗。圖三：轉(zhuǎn)膜示意圖6.將膜放入塑料盒中，加入封閉液至沒(méi)過(guò)膜面，置脫色搖床中緩慢搖動(dòng)，室溫1小時(shí)。②靶蛋白與第一抗體結(jié)合1．棄去封閉液，加入含有第一抗體的封閉液約10ml，室溫平緩搖動(dòng)溫育1小時(shí)。然后放入4℃冰箱孵育過(guò)夜；2．第二天早上回收一抗，用TBST室溫洗膜3次，每次約20mLTBST，每次搖床約10min；3．棄去TBST，加入適量約10ml含有第二抗體的封閉液，混勻后加入盒中，室溫?fù)u1小時(shí)；4．回收二抗，將膜用TBST洗4次，每次沒(méi)過(guò)液面，每次搖床約10min，提前5min告訴老師以便配制DAB顯跡液（1.5mlNBT，1.5mlBCIP加入30mlAP反應(yīng)液中），將膜放入顯色，觀(guān)察條帶的出現(xiàn)，晾干膜，拍照并保存。結(jié)果如下圖四所示：Marker1234KD1701309572554334261710圖四：westernblot顯示點(diǎn)樣順序：ProteinMWstandMarker1：離心上清2：300mM咪唑洗脫峰3：50mM咪唑洗脫峰4：穿流峰從上圖可以看出，剪膜時(shí)出現(xiàn)差錯(cuò)，將3、4號(hào)泳道剪掉，原因是marker并非點(diǎn)在最左端，為方便標(biāo)記分子量圖中未畫(huà)出PVDF膜左側(cè)的膜，因而剪膜時(shí)對(duì)點(diǎn)樣在marker左側(cè)還是右側(cè)判斷失誤，當(dāng)時(shí)以為點(diǎn)樣在左側(cè)，結(jié)果將右