單克隆抗體的標(biāo)記

單克隆抗體的標(biāo)記（酶標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、同位素標(biāo)記和生物素標(biāo)記）目前動(dòng)物用單抗，在動(dòng)物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測(cè)、性別鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用，大多以診斷試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標(biāo)記的單抗。下面將介紹最常用的幾種標(biāo)記技術(shù)。一、酶標(biāo)記1、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記單抗和多克隆抗體的常用方法是過(guò)碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。程序一：（1） 將5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中；^口0.5ml10mmol/LNaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。（2） 加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混勻。（3）加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。（4）稱(chēng)取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時(shí)或4°C過(guò)夜。（5） 用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/mlNaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)（或4C過(guò)夜）。（6） 將交聯(lián)物過(guò)SephadexG200或Sepharose6B（2.6X50cm）層析純化，分管收集第一峰。（7） 酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：克分子比值測(cè)定酶量（mg/ml）=OD403X0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403X0.3）X0.62克分子比值（E/P）=酶量X4/IgG量，一般在1-2之間。酶結(jié)合率=酶量X體積/抗體，標(biāo)記率一般為0.3-0.6，即1-2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4時(shí)，E/P約為1。標(biāo)記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測(cè)定可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、DAB-H2O2顯色反應(yīng)測(cè)定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20°C存放，防止反復(fù)凍融；或加入等量60%甘油4C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會(huì)影響酶活性。必要時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。程序二：將5mgHRP溶于0.3mol/LPH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液0.1ml，室溫?cái)嚢枳饔?小時(shí)，以封閉HRP分子上的a和e氨基。再加1ml0.06mol/L