第九章幾種特殊酶課件

第九章幾種特殊酶第一節(jié)模擬酶一、模擬酶的概念模擬酶(EnzymeMimics)：又稱人工合成酶(Synzymes)，是一類利用有機化學方法合成的比天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結(jié)合和催化過程。分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征及作用機制模擬酶兩個特殊部位：底物結(jié)合位點和催化位點構(gòu)成底物結(jié)合位點比較容易，而構(gòu)建催化位點比較困難模擬酶的酶學基礎(chǔ)酶的作用機制：過渡態(tài)理論對簡化的人工體系中識別、結(jié)合和催化的研究設(shè)計要點設(shè)計前：酶活性中心-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)酶的專一性及其同底物結(jié)合的能力反應(yīng)的動力學及各中間物的知識設(shè)計要點設(shè)計中：為底物提供良好的微環(huán)境催化基團必須盡可能同底物的功能團相接近應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性二、模擬酶的性質(zhì)（1）具有一個良好的疏水鍵合區(qū)來和底物發(fā)生相互作用；（2）能與底物形成靜電或氫鍵等相互作用，并以適當?shù)姆绞较嗷ユI合；（3）模擬酶的結(jié)構(gòu)對底物鍵合的方向和立體化學應(yīng)該具有專一性。天然酶的模擬工作主要從下面三個層次進行：（1）合成有類似酶活性的簡單配合物；（2）酶活性中心模擬，即在天然或人工合成的化合物中引入某些活性基團，使其具有酶的催化能力；（3）整體模擬，即包括微環(huán)境在內(nèi)的整個酶活性部位的化學模擬。三、幾種模擬酶的類型1．環(huán)糊精模擬酶環(huán)糊精(cyclodextrin,CD)是直鏈淀粉在由芽抱桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱。

圖11-1環(huán)糊精的分子模型α-1，4糖苷鍵輪胎狀三種環(huán)狀糊精的結(jié)構(gòu)相似，但其水溶解度、穴洞大小等方面存在差別環(huán)糊精（CD）中每個葡萄糖殘基6-位的伯羥基和2,3-位的仲羥基都位于穴洞外面上下邊緣，所以上下兩側(cè)分別具有親水性或極性。洞穴內(nèi)壁為氫原子和糖苷鍵氧原子，具有疏水性或非極性。326CD分子的特殊結(jié)構(gòu)使其能識別捕捉一般大小的底物分子，模擬酶的識別作用。把類似于酶活性基團的小分子修飾到環(huán)糊精上，可以模擬酶對有機化合物的催化水解、轉(zhuǎn)氨基以及氧化還原作用等等。目前為止，以環(huán)糊精為基本結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精模擬模型已成功對水解酶、核酸酶、轉(zhuǎn)氨酶、氧化還原酶進行了模擬。例如：在CD側(cè)鏈連上羧基、咪唑基以及其自身的羥基成功模擬胰凝乳蛋白酶對叔丁基苯乙酸酯胰凝乳蛋白酶模擬酶核糖核酸酶模擬酶核糖核酸酶活性中心基團：組氨酸，賴氨酸2．大環(huán)聚醚及其模擬酶

這類模擬酶含有一個能夠配合各種離子和分子的完全閉環(huán)或者是鉗型的空穴，可以對底物進行包結(jié)。圖

冠醚水解模擬酶的分子模型已經(jīng)成功利用冠醚化合物模擬了水解酶和肽合成酶等多種酶活性?？梢源呋被釋Γ趸锦ニ?．膜體系及其模擬酶膜體系是由多個分子共同構(gòu)成對底物有結(jié)合作用的空穴。膠束由表面活性物質(zhì)組成，其分子通常包含親油基和親水基兩部分，親油基是含8個碳原子以上的碳鏈，親水基是帶電基團或極性基團。水中的表面活性物質(zhì)聚集就形成膠束。膠束在水溶液中提供了疏水微環(huán)境，類似于酶的結(jié)合位點，將催化基團和一些輔因子連接在膠束上，提供了類似酶活性中心的催化部位，使膠束成為具有酶活力的模擬酶。膠束酶模型包括引入組氨酸的咪唑基模擬水解酶的膠束酶模型、以及金屬配合物與表面活性劑共同形成的金屬膠束酶模型、逆向膠束模擬酶等。圖膠束示意圖膠束酶模型例：N-十四酰基組氨酸所形成的膠束催化對硝基苯酚乙酸酯水解，催化效率比不能形成膠束的N-乙?；M氨酸高3300倍。4．聚合物及其模擬酶

某些聚合物由于結(jié)構(gòu)的特殊性，其內(nèi)部可形成對底物結(jié)合的微環(huán)境。例如：多分枝聚亞乙基亞胺（PEI）的分子有多個支鏈，支鏈在立體空間相互交錯，可以在局部形成多個疏水微環(huán)境作為底物的結(jié)合部位，帶有十二烷基和乙基側(cè)鏈的PEI可以催化脫羧反應(yīng)。5．金屬卟啉及其模擬酶金屬卟啉可以模擬以金屬離子為輔酶或輔因子的天然酶。例如：釕卟啉可以模擬SOD酶和過氧化氫酶6．肽酶肽酶是模擬天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。

1977年人工合成的八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe，具有溶菌酶的活性，其活力達到天然酶的50％。

第一個合成的能結(jié)合離子的環(huán)肽，模擬纈氨霉素結(jié)構(gòu)，有兩個二硫鍵。環(huán)肽即具有氫鍵供體具有氫鍵受體，所以具有同時識別陰離子和陽離子能力。第二節(jié)核酶核酶（ribozyme）：具有催化活性的RNA分子稱為核酶，也稱RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)使人們對“酶”的認識從蛋白質(zhì)領(lǐng)域延伸到核酸領(lǐng)域，是一個重要的里程碑。核酶可以通過堿基配對特異性地與相應(yīng)的RNA底物結(jié)合，在特定的位點切割底物RNA分子，是一類很有希望的基因功能阻斷劑，被形象地稱為“分子剪刀”。核酶的種類：大分子核酶：I型內(nèi)含子、II型內(nèi)含子、RNA酶P的RNA亞基小分子核酶：錘頭狀核酶、發(fā)夾狀核酶及丁型肝炎病毒核酶催化分子內(nèi)反應(yīng)（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子間反應(yīng)(intrans)的ribozyme。

一、大分子核酶的結(jié)構(gòu)及催化機理1.I型內(nèi)含子的自我剪接1982年Cech研究組在研究四膜蟲26srRNA的轉(zhuǎn)錄后加工問題時發(fā)現(xiàn)該rRNA前體有自我剪接的能力。在SDS、酚類、蛋白水解酶、蛋白變性劑等方法完全去除蛋白質(zhì)下，該rRNA前體有自我剪接的能力。核酶的活性需要內(nèi)含子折疊成一定的空間結(jié)構(gòu)。需要Mg2＋和鳥嘌呤核苷酸L-19RNAL-19RNA具有polyC聚合酶活性、還有轉(zhuǎn)核苷酸作用（核苷酸轉(zhuǎn)移酶）、水解作用（磷酸二酯酶）、轉(zhuǎn)磷酸作用（磷酸轉(zhuǎn)移酶）、去磷酸作用（磷酸酯酶）、RNA限制性內(nèi)切酶作用具有經(jīng)典酶催化反應(yīng)的標志：底物專一性、符合米氏方程、對競爭性抑制劑敏感2.II型內(nèi)含子的自我剪接不需要鳥嘌呤核苷酸需要Mg2＋套索結(jié)構(gòu)中的A有3個磷酸酯鍵3.RNA酶P的RNA亞基(M1RNA)RNaseP是一種5’-內(nèi)切核酸酶，負責tRNA前體5’端的成熟。該酶是核糖核蛋白（由RNA和蛋白質(zhì)組成）。大腸桿菌的RNaseP-RNA稱為M1RNA，由377個堿基組成，其RNaseP-蛋白質(zhì)成為C5蛋白質(zhì)，由119個氨基酸組成。在高Mg2+濃度下，M1RNA單獨存在就具有催化活性。而C5蛋白無論在何種條件下都無催化活性。M1RNA是真正的生物催化劑，因為它符合催化劑的條件：在體外能催化別的分子的切割反應(yīng)；少量的M1RNA就能使反應(yīng)大大加速；自身在反應(yīng)前后不改變。C5蛋白是輔助因子，起維護RNA構(gòu)象的作用。二、小分子核酶的結(jié)構(gòu)及催化機理1．錘頭狀核酶錘頭狀核酶：其與底物結(jié)合后呈現(xiàn)一種錘頭狀結(jié)構(gòu)，含13個保守核苷酸殘基和3個螺旋域。核酶的側(cè)翼序列以堿基配對的方式與靶RNA特異結(jié)合底物切割點5-端為NUX三體結(jié)構(gòu)（N為AorGorCorU；X為AorCorU），比較典型的切割靶位是GUC三體后的位點

2．發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)其基本結(jié)構(gòu)包括4個螺旋區(qū)及5個環(huán)狀區(qū)，其識別的底物序列為NGUC（其中N為AorGorUorC），切割位點在GUC上游。核酶的催化作用機制催化性均依賴其三級結(jié)構(gòu)均含能與底物發(fā)生堿基互補的區(qū)域。切割反應(yīng)主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)酯化過程：由靠近切割位點3-端的2-OH或氧原子對切割位點的磷原子實施親核攻擊，產(chǎn)物是2,3-環(huán)化磷酸二酯和5-OH基。假如缺乏2-OH或自我切割位點5-端為脫氧核苷酸，一般不能產(chǎn)生切割效應(yīng)。三、影響核酶活性的因素

1．pH

核酶一般在pH7.0~7.5時活性最高。

2．溫度大多數(shù)核酶在37℃時均具有適宜的活性。

3.二價金屬陽離子核酶在細胞內(nèi)發(fā)揮作用需要Mg2+、Mn2+等二價金屬陽離子的參與

4.抗生素抗生素對核酶的活性大多數(shù)表現(xiàn)出抑制效應(yīng)5．變性劑變性劑對核酶活性的影響可能與變性劑的濃度及各核酶的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)等有關(guān)。

例如：0.5mmol/L亞精胺可在一定程度上提高HDV核酶的切割效率。適宜濃度的甲酰胺和尿素（5~7mol/L左右）可促進基因組核酶（gRz184）和抗基因組核酶（agRzl84）的自我切割。gRz1066活性隨甲酰胺濃度增加而下降。四、核酶的應(yīng)用

1．在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用

對核酶的研究有利于揭開生命起源的奧秘。某些催化基本生化反應(yīng)的核酶的發(fā)現(xiàn)支持了在蛋白質(zhì)產(chǎn)生以前，核酶可能參與催化最初的新陳代謝的設(shè)想合成了能催化RNA復(fù)制的核酶闡明某些細胞學方面的基本問題2.在生物醫(yī)學上的應(yīng)用核酶作為基因治療的優(yōu)點①一個核酶分子可切割多個病毒核酸分子②其作用是切斷不是單純抑制③較好的特異性④針對多個靶位設(shè)計串狀排列的核酶，可提高切割效率，減少變異病毒逃逸的機會；⑤兼具反義抑制效果?？笻IV病毒，抗肝炎病毒感染、腫瘤治療等脫氧核酶具有酶活性的DNA分子稱為脫氧核酶Carmi等通過體外選擇技術(shù)合成了一種依賴Ca2+的具有自我切割功能的手槍型二級結(jié)構(gòu)脫氧核酶分子第三節(jié)抗體酶酶與抗體的差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化性物質(zhì)，抗體是和基態(tài)分子結(jié)合的物質(zhì)?？贵w酶（abzyme）：是具有酶催化功能的抗體分子，本質(zhì)為免疫球蛋白，在可變區(qū)被賦予了酶的屬性，故又被稱為催化抗體（CatalyticAntibody）。它既具有抗體的高度選擇性，又具有酶的高效催化效率。一、抗體酶的特性抗體酶具有典型的酶反應(yīng)特性專一性：抗體酶催化反應(yīng)的專一性可以達到甚至超過天然酶的專一性；催化的高效性：一般抗體酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)快103～108倍，有的反應(yīng)速度已接近于天然酶促反應(yīng)速度抗體酶還具有與天然酶相近的米氏方程動力學及pH依賴性等。二、抗體酶的制備1．誘導(dǎo)法采用過渡態(tài)類似物為半抗原和載體蛋白（例如牛血清白蛋白等）一起對動物進行免疫，然后采用標準的單克隆抗體來制備、分離、篩選抗體酶圖11-5利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶示意圖

圖11-6羧酸酯水解反應(yīng)機理利用過渡態(tài)類似物制備抗體酶方法的關(guān)鍵在于過渡態(tài)類似物的正確設(shè)計。設(shè)計過渡態(tài)類似物的指導(dǎo)性原則有形狀、電性、酸－堿匹配等。例如，酯水解反應(yīng)的過渡態(tài)是帶電的四面體結(jié)構(gòu)，因而可選用具有四面體結(jié)構(gòu)的帶電磷酸酯作為過渡態(tài)類似物。2．拷貝法

用已知的酶作為抗原免疫動物，再以此種抗體免疫動物，經(jīng)篩選與純化，就可獲得具有原來酶活性的抗體酶。優(yōu)點：操作簡單，對于自然界來源稀少的緊缺酶來說，可大規(guī)模生產(chǎn)。不足之處：這類抗體酶需要篩選獲得，具有一定的盲目性，且不能形成新的抗體酶。酶第一次免疫第二次免疫單克隆化抗體酶

圖11-7拷貝法示意圖3．化學修飾法（引入法） 采用選擇性化學修飾的方法將人工合成的或天然存在的催化基團引入抗原結(jié)合部位，使其獲得催化功能。 可采用化學修飾或寡核苷酸定點誘變技術(shù)將含巰基的柄狀親核基團引入到抗2，4一二硝基苯酚（DNP）的單抗MOPC315的抗原結(jié)合位點。得到的抗體酶對含有DNP與香豆素的羧酸酯的水解反應(yīng)的催化效率比二硫蘇糖醇（DTT）高6X104倍4．引入輔助因子法將引入某輔助因子的半抗原通過共價鍵連接在載體蛋白上免疫動物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性對肽鍵進行水解。5．天然來源抗體酶在全身紅斑狼瘡病人的血清中已分離出抗體酶，它具有催化水解DNA的活性。表明在有免疫性缺陷的病人體內(nèi)存在著抗體酶。6．基因工程法

利用PCR技術(shù)將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因克隆出來，重組到原核表達載體，通過大腸桿菌直接表達有功能的抗體功能片斷，再經(jīng)過化學誘變，獲得具有催化活性的抗體酶。 該法可篩選具有特定功能的未知結(jié)構(gòu)，具有生產(chǎn)簡單、價格低、降低抗體的免疫原性、易獲得稀有抗體的優(yōu)點

例如：黃華梁等利用RT－PCR從分泌有谷胱甘肽結(jié)合部位的單克隆抗體雜交瘤細胞株2F3中，擴增出單抗重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，經(jīng)DNA測序后，用linker（Gly4Serl）3構(gòu)建成單鏈抗體（scFv）表達載體pTMF-scFv，將重組質(zhì)粒pTMF-scFv轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3），實現(xiàn)了單鏈抗體的高效表達，經(jīng)過金屬螫合親和層析純化、復(fù)性和凝膠過濾純化，得到電泳均一的單質(zhì)抗體，再經(jīng)化學誘變，得到含硒單鏈抗體酶三、抗體酶催化的反應(yīng)類型

反應(yīng)類型包括酯水解、酰胺水解、?；D(zhuǎn)移、環(huán)合反應(yīng)、光誘導(dǎo)反應(yīng)、氧化一還原反應(yīng)、Claisen重排反應(yīng)、金屬螯合反應(yīng)、脫羧反應(yīng)、三苯基水解反應(yīng)、過氧化反應(yīng)、烯烴的異構(gòu)化反應(yīng)等。四、抗體酶的應(yīng)用

1．在有機合成中的應(yīng)用

2．在前藥設(shè)計中的應(yīng)用

第四節(jié)極端酶一、極端微生物和極端酶

極端微生物：生活在地球上最極端環(huán)境條件下的有機生命，又稱為嗜極菌（extremophiles）極端酶：指那些可在非常規(guī)條件下作用的酶。包括嗜熱酶、嗜冷酶、嗜酸酶、嗜堿酶、嗜壓酶、嗜鹽酶、耐有機溶劑酶、耐抗代謝物酶及耐重金屬酶等極端酶根據(jù)來源分為三種：①極端微生物（細胞）中分