糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果

/wswxtbcnJul.20,2023,50(7):2860?2Copyright?2023MicrobiologyChinaAllRightsReserved研究報(bào)告研究報(bào)告1國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京1000372糧食儲(chǔ)運(yùn)國家工程研究中心，北京1022093北京農(nóng)學(xué)院，北京102206祁智慧祁智慧,莊媛,張海洋,田琳,唐芳.糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果[J].微生物學(xué)通報(bào),2023,50(7):2860-2875.QIZhihui,ZHUANGYuan,ZHANGHaiyang,TIANLin,TANGFang.Isolation,identification,andbiocontrolefficacydeterminationofTrichodermaspp.ongrains[J].MicrobiologyChina,2023,50(7):2860-2875.摘要：【背景】糧食在生長和收儲(chǔ)期極易受到病原真菌或產(chǎn)毒真菌的污染，造成嚴(yán)重的損失。眾多實(shí)踐證明木霉屬(Trichoderma)可以有效防治植物病原真菌?！灸康摹胯b定和篩選能有效抑制糧食常見危害真菌的木霉生防菌株，開發(fā)生防菌劑，保障糧食生產(chǎn)安全。【方法】從糧食上分離篩選出35株木霉，通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析和形態(tài)學(xué)觀察方法進(jìn)行菌種鑒定，利用平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選出對(duì)糧食常見危害真菌有抑制作用的菌株?！窘Y(jié)果】35株木霉分屬于8個(gè)種，分別為非洲哈茨木霉(Trichodermaafroharzianum)、類棘孢木霉(Trichodermaasperelloides)、Trichodermaamoenum、近深綠木霉(Trichodermaparatroviride)、Trichodermaobovatum、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、東方木霉(Trichodermaorientale)和深綠木霉(Trichodermaatroviride)。對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，這8種木霉對(duì)于糧食上分離到的10種危害真菌均具有較好的抑制效果。非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)和長枝木霉(T.longibrachiatum)的抑菌效果優(yōu)于其他物種，其中非洲哈茨木霉a91菌株的抑菌效果最佳，對(duì)9種危害真菌的抑菌率均在65%以上?！窘Y(jié)論】本研究篩選的木霉菌株具有較高的生防潛力，對(duì)于糧食作物上常見的病原菌和產(chǎn)毒真菌有較好的抑制效果。關(guān)鍵詞：糧食；木霉；鑒定；抑菌作用資助項(xiàng)目：中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(ZX2202)ThisworkwassupportedbytheCentralPublic-InterestScientificInstitutionBasalResearchFund(ZX2202).*Correspondingauthor.E-mail:tf@Received:2022-09-19;Accepted:2023-02-07;Publishedonline:2023-03-31 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2861 Isolation,identification,andbiocontrolefficacQIZhihui1,2,ZHUANGYuan1,3,ZHANGHaiyang1,2,TIANLin1,2,TANGFang*1,21AcademyofNationalFoodandStrategicReservesAdministration,Beijing100037,ChinaLogistics,Beijing102209,ChinaAbstract:[Background]Grainsareeasilycontaminatedbypathogenicfungiandtoxigenicfungiduringthegrowth,harvest,andstoragestages,whichresultsinseriouslosses.PracticesandstudieshaveprovedthatthepathogenicfungiofplantscanbecontrolledeffectivelybyTrichodermaspecies.[Objective]ToidentifyandscreenthestrainsforthebiocontrolofTrichodermaongrainsanddevelopbiocontrolfungicidesforensuringgrainsecurity.[Methods]Inthisstudy,35strainsofTrichodermawereisolatedfromgrains.Theywereidentifiedbasedonbothmulti-genephylogeneticrelationshipandmorphologicalcharacteristics.Plateconfrontationexperimentswereconductedtoselectthestrainswithantagonisticeffectsoncommondeleteriousfungi.[Results]EightspeciesofTrichodermawereidentified,includingTrichodermaafroharzianum,Trichodermaasperelloides,Trichodermaamoenum,Trichodermaparatroviride,Trichodermaobovatum,Trichodermalongibrachiatum,Trichodermaorientale,andTrichodermaatroviride.TheantagonisticassaydemonstratedthattheseeightTrichodermaspecieshadantagonismon10deleteriousfungalspeciesfromgrains.TheantifungalefficacyofT.afroharzianumandT.longibrachiatumwasbetterthanthatofotherspecies.Thea91strainofT.afroharzianumshowedthebestantifungalefficacy,withtheinhibitionratesmorethan65%against9deleteriousfungalspecies.[Conclusion]TheTrichodermastrainsscreenedoutinthisstudyhavegreatapplicationpotentialforbiocontrolandstronginhibitoryeffectoncommonpathogenicfungiandtoxigenicfungiisolatedfromgraincrops.Keywords:grains;Trichodermaspp.;identification;antif小麥、玉米和稻谷是我國重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備糧種，其數(shù)量、品質(zhì)和衛(wèi)生安全十分重要。研究發(fā)現(xiàn)糧食作物在生長和收儲(chǔ)期易受各種病原真菌和產(chǎn)毒真菌的侵染，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)或真菌毒素污染[1]DON)是小麥及小麥制品中的主要污染毒素，與赤霉病(Fusariumheadblight,FHB)的暴發(fā)有關(guān)，禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)和串珠鐮孢(Fusariumverticillioides)在小麥孕穗期至成熟期感染麥穗會(huì)引起FHB，也預(yù)示著該地區(qū)收獲的小麥面臨DON毒素超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)[2]。然而鐮孢屬(Fusarium)引起的病害和毒素污染僅僅代表糧食上少數(shù)真菌的特性。糧食上真菌種類繁多，有些物種可以侵染糧食作物引起病害甚至產(chǎn)生真菌毒素污染，還有一些物種對(duì)產(chǎn)毒真菌或病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，可作為糧食作物上危害真菌的生物防治劑[3-4]。木霉(Trichodermaspp.)是在植物病害生物防治中研究和應(yīng)用非常廣泛的一類生防真菌，普遍存在于土壤、植物種子、葉圍等各種環(huán)境TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2862微生物學(xué)通報(bào)Micro中，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)[5]。研究表明木霉屬至少有25個(gè)種對(duì)病原真菌具有生防作用[4]，其中一些菌種已經(jīng)商業(yè)化作為生物農(nóng)藥或生物肥料[6]。目前國內(nèi)注冊(cè)登記的木霉生防制劑主要用于果蔬種植且生防效果參差不齊，因此，木霉作為糧食作物病原菌和產(chǎn)毒真菌生防菌劑的開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。木霉生防菌劑應(yīng)用比較廣泛的菌株包括非洲哈茨木霉T22、綠色木霉LTR-2、哈茨木霉SH2303和SQR-T-037等，主要用于果蔬的病害防治[7]。He等[8]研究了木霉生物防治劑對(duì)禾谷鐮孢和串珠鐮孢引起的玉米莖腐病和穗腐病的防治效果，發(fā)現(xiàn)棘孢木霉的生物防治劑能有效抑制玉米莖腐病和穗腐病，在棘孢木霉處理的土壤中生長的玉米莖和穗中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬菌素的積累明顯減少。Swain等[9]研究表明，從樹皮中分離的木霉菌株可作為水稻的潛在生物防治劑和生物肥料直接用于水稻種子，能有效控制土傳病害的發(fā)生并增強(qiáng)水稻種子的發(fā)芽率和活力。我國專門針對(duì)糧食作物病原菌和產(chǎn)毒真菌生防菌劑開發(fā)的研究較少，市面上缺少糧食作物專用的木霉菌生物防治劑，所以有必要尋求更多對(duì)糧食作物病原真菌和產(chǎn)毒真菌更有效的木霉菌株加入生物防治的隊(duì)伍中，為深入探究木霉菌與其他微生物聯(lián)合作用的抑菌機(jī)制、開發(fā)用于糧食作物生長過程的復(fù)合生防菌劑奠定基礎(chǔ)。本研究采用形態(tài)學(xué)觀察及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法對(duì)糧食籽粒上分離到的木霉菌株進(jìn)行鑒定，通過木霉菌與糧食籽粒上常見病原真菌及產(chǎn)毒真菌的對(duì)峙試驗(yàn)，進(jìn)行木霉菌生防潛力測定，以期篩選出高效拮抗的木霉菌株，為糧食真菌病害和真菌毒素污染的生物防治提供菌種資源。本研究的材料為我國各省糧油質(zhì)檢站及糧庫收集到的收獲期(從田間收獲)及儲(chǔ)藏期(糧倉儲(chǔ)藏)小麥、稻谷和玉米樣品。稻谷樣品取自黑龍江、吉林、遼寧、北京、寧夏、四川、重慶、安徽、湖北、湖南、江西、福建和廣西這13個(gè)地區(qū)，共78份樣品。小麥樣品取自河北、江蘇、安徽、山東、河南、山西、內(nèi)蒙古、湖北、四川、陜西、甘肅和新疆這12個(gè)地區(qū)，共200份樣品。玉米樣品取自遼寧和廣東，共32份。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potatodextroseagar,PDA)培養(yǎng)基(g/L)：去皮馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0；玉米粉瓊脂(cornmealdextroseagar,CMD)培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉40.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0；麥芽提取物瓊脂(maltextractagar,MEA)培養(yǎng)基(g/L)：麥芽提取物20.0，瓊脂18.0；NirenbergSNA培養(yǎng)基(g/L)：磷酸二氫鉀1.0，硝酸鉀1.0，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，葡萄糖0.2，蔗糖0.2，瓊脂18.0。十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，寶泰克生物科技公司；2×TaqPCRMix和DL2000DNAMarker，天根生化科技(北京)有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司?？蒲屑?jí)生物凝膠成像分析儀，Bio-Rad公司。1.2菌株的分離選擇PDA培養(yǎng)基采用梯度稀釋平板法對(duì)糧食樣品中的真菌進(jìn)行分離。取25g糧食樣品于225mL的無菌水中充分振蕩洗滌制成濃度為10?1的菌懸液，依次將其稀釋成濃度為10?2和10?3的菌懸液。取1mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，將15–30mL冷卻至50℃左右已加50μg/mL氯霉素的PDA培養(yǎng)基倒入含菌懸浮TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2863 液的培養(yǎng)皿中。25℃培養(yǎng)5–7d后，待菌落長出后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并挑取單菌落邊緣轉(zhuǎn)移至新的平板上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3–4次后獲得純化菌株。1.3菌株的鑒定1.3.1形態(tài)特征鑒定菌落形態(tài)觀察基于PDA、CMD、MEA和NirenbergSNA培養(yǎng)基，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察菌落生長速度、生長新區(qū)的特征、顏色、結(jié)構(gòu)、質(zhì)地及其變化，確認(rèn)培養(yǎng)物的氣味等。微觀形態(tài)特征觀察使用科研級(jí)生物顯微鏡，觀察分生孢子梗、分生孢子及厚垣孢子的形態(tài)特征[10]。1.3.2分子鑒定使用改良的CTAB法提取所獲得純菌株的基因組DNA。然后對(duì)菌株的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，然后將基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，經(jīng)比對(duì)分析篩選出木霉菌株。然后對(duì)初步確認(rèn)為木霉菌株的聚合酶Ⅱ第二大亞基(RNApolymeraseIIsubunitB,rpb2)和翻譯延長因子1α(translationelongationfactor1-α,tef1)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。其中ITS擴(kuò)增選擇引物對(duì)ITS4/ITS1，rpb2基因擴(kuò)增選擇引物對(duì)fRPB2-5f/fRPB2-7cr，tef1基因擴(kuò)增選擇引物對(duì)EF1-728F/引物的信息及PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)見表1[11]。將獲得的全部ITS、rpb2和tef1基因序列進(jìn)行在線同源比對(duì)分析，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果從GenBank下載與之相關(guān)的參考序列。用MEGA7軟件將全部序列比對(duì)并矯正后，用MEGAX軟件按ITS-rpb2-tef1的順序首尾相連，菌株P(guān)rotocreafarinosaCPK3144作為外群。系統(tǒng)發(fā)育分析在RaxML軟件中進(jìn)行，選擇GTR-GAMMA模型進(jìn)行計(jì)算，采用最大似然(maximumlikelihood,ML)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以自展(bootstrap)進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次。Bootstrap>50%的顯示在各個(gè)進(jìn)化分支節(jié)點(diǎn)上。1.4.1糧食危害真菌本試驗(yàn)室前期開展的糧食真菌多樣性研究中獲得了大量菌株，完成菌種鑒定后對(duì)單菌株進(jìn)行了保藏。根據(jù)前人的研究[12]，選擇糧食上分離的常見病原真菌和產(chǎn)毒真菌共10株開展后續(xù)對(duì)峙試驗(yàn)。具體菌株包括層出鐮孢(F.proliferatum)F26、串珠鐮孢(F.verticillioides)N49、禾谷鐮孢(F.graminearum)E45、黃曲霉(Aspergillusflavus)S17、黑曲霉(Aspergillusniger)S36、鏈格孢roseum)E427、澳大利亞彎孢(Curvulariaaustraliensis)H34、新月彎孢(Curvularialunata)N26和卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)E781。表1不同基因?qū)?yīng)的PCR引物及反應(yīng)條件Table1DetailsofgeneswithPCRprimersandreactionconditions基因Gene引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′→3′)反應(yīng)條件ReactionconditionITSITS1/ITS4CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAArpb2fRPB2-5f/fRPB2-7crCCCATRGCTTGYTTRCCCAT2min,35cycles;72℃10mintef1EF1-728F/TEF1LLErevCATCGAGAAGTTCGAGAAGGAACTTGCAGGCAATGTGG2min,30cycles;72℃10minTelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2864微生物學(xué)通報(bào)Micro1.4.2對(duì)峙試驗(yàn)采用直徑6mm打孔器在已活化培養(yǎng)7d的上述10種危害真菌菌株和木霉菌株的菌落邊緣打取菌塊，在距離PDA平板(直徑9cm)邊緣約10mm相對(duì)應(yīng)的兩點(diǎn)上分別接種直徑6mm的危害真菌和木霉菌菌塊各1片，置于28℃暗培養(yǎng)。在3–11d時(shí)采用十字交叉法測定并記錄對(duì)峙和非對(duì)峙條件下危害真菌的菌落生長半徑。每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。木霉菌抑菌率(%)=[(對(duì)照病原菌菌落半徑?對(duì)峙培養(yǎng)的病原菌菌落半徑)/對(duì)照病原菌菌落半徑]×100。挑取上述對(duì)峙培養(yǎng)條件下木霉菌與危害真菌菌落相交處的菌絲體，在顯微鏡下觀察二者相互作用，用顯微鏡配套鏡頭AxioCamMRc5和Zen軟件進(jìn)行拍照和圖片處理，進(jìn)一步明確木霉菌株對(duì)糧食危害真菌的抑制作用機(jī)制。1.4.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析ANOVA對(duì)不同木霉菌株的抑菌率進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，并使用TukeyHSD對(duì)方差分析結(jié)果進(jìn)行事后檢驗(yàn)。2結(jié)果與分析2.1木霉菌株的形態(tài)鑒定從糧食樣品共分離獲得35株木霉，根據(jù)菌落特征和顯微形態(tài)特征觀察(表2和圖1、圖2)，結(jié)果表明35個(gè)木霉菌株屬于8個(gè)物種，即非洲哈茨木霉(a69、a77、a78、a80、a90、a91、a92、a93、a98、a115、a124、a141、E708、E873、E874、H23)、類棘孢木霉(a67、a102、a103、a104、a105)、T.amoenum(a126)、近深綠木霉E106、E356、E357、E475、E473、D612)、東方木霉(E225、E589)和深綠木霉(E339)。2.2木霉菌株分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析采用基于3個(gè)基因片段的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對(duì)木霉屬菌株進(jìn)行鑒定(圖3)。最終得到的比對(duì)數(shù)據(jù)集包含35個(gè)分離菌株和80個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株(圖3)，包括2091個(gè)堿基(ITS為546，rpb2為666，tef1為879，包括比對(duì)間隙)，菌株P(guān).farinosaCPK3144作為外群。最終確認(rèn)木霉屬的35個(gè)菌株分別為非洲哈茨木霉、類棘孢木霉、T.amoenum、近深綠木霉、T.obovatum、長枝木霉、東方木霉和深綠木霉。研究相關(guān)分離株的基因序列已經(jīng)全部提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)見表3。2.3木霉菌對(duì)糧食危害真菌的抑制作用2.3.1不同木霉菌對(duì)糧食危害真菌的抑菌效果差異比較選擇代表性木霉屬菌株，包括：非洲哈茨木霉7株(a69、a80、a91、a98、a124、E874、H23)，類棘孢木霉1株(a67)，T.amoenum1株(a126)，近深綠木霉1株(a131)，T.obovatum1株(E95)，長枝木霉3株(E357、E475、D612)，東方木霉1株(E589)和深綠木霉1株(E339)，共16個(gè)菌株作為拮抗菌株，與糧食上分離的10個(gè)危害真菌菌株(1.3.1)進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)。培養(yǎng)第11天時(shí)，16個(gè)分離株抑菌效果的差異比較見表4，將對(duì)每種危害真菌抑制效果前2名的菌株及其抑菌率進(jìn)行匯總整理，結(jié)果見表5。對(duì)危害菌抑菌效果最明顯的木霉菌株的平板對(duì)峙效果見圖4。分析可知，16株木霉菌對(duì)10種糧食危害真菌均有一定的抑制作用，抑菌率為40%–80%，不同物種或同一物種的不同分離株對(duì)同一種危害真菌的抑菌能力不同。非洲哈茨木霉的抑菌效果明顯優(yōu)于其他物種。非洲哈茨木霉a91的抑菌效果最好，其對(duì)鏈格孢E2、層出鐮孢F26、禾TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2865 表2木霉屬物種的主要形態(tài)特征Table2MainmorphologicalcharacteristicsofTrichoderma分生孢子近球形至卵形，光滑，綠色至深綠色，很Conidiasubglobosetoovoid,smooth,greento分生孢子近球形至橢圓形，表面具細(xì)疣，綠Conidiasubglobosetooval,finelywarted,ConidiaovalorsubspheroidaConidiagloboseorsubglobos分生孢子球形、橢圓形至倒卵形，較少呈現(xiàn)長方形Conidiaglobose,ovaltoobovate,lesscommonlyoblnotedConidiabroadlyoval,green,smoothnotedConidiaoblongtobroadlyovConidiasubglobosetoovoid,da谷鐮孢E45、黃曲霉S17、粉紅單端孢霉E427和新月彎孢N26的抑菌率均在70%以上，對(duì)串珠鐮孢N49、黑曲霉S36和澳大利亞彎孢H34的抑菌率也在65%以上。非洲哈茨木霉a98、a124和E874也有較好的抑菌效果，對(duì)除卷枝毛霉E781外的9種危害真菌的抑菌率達(dá)55%以上。長枝木霉E475和D612對(duì)除黑曲霉S36和澳大利亞彎孢H34外的其余8種危害真菌的抑菌率均在55%以上，也有較好的抑菌效果。試驗(yàn)中，近深綠木霉a131對(duì)層出鐮孢F26和卷枝毛霉E781的抑菌效果優(yōu)于其他木霉菌株。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2866微生物學(xué)通報(bào)Micro圖1非洲哈茨木霉、類棘孢木霉、Trichodermaamoenum和近深綠木霉的形態(tài)特征A：CMD培養(yǎng)基.B：MEA培養(yǎng)基.C：PDA培養(yǎng)基.D：NirenbergSNA培養(yǎng)基.E：分生孢子.F：厚垣孢子.G、H：分生孢子梗和瓶梗.標(biāo)尺：10μmFigure1MorphologicalcharacteristicsofTrichodermaafroharzianum,Trichodermaasperelloides,TrichodermaamoenumandTrichodermaparatroviride.A:CMDmedium.B:MEAmedium.C:PDAmedium.D:NirenbergSNAmedium.E:Conidia.F:Chlamydospores.G,H:Conidiophoresandphialides.Bar:10μm.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2867 圖2Trichodermaobovatum、長枝木霉、東方木霉和深綠木霉的形態(tài)特征A：CMD培養(yǎng)基.B：MEA培養(yǎng)基.C：PDA培養(yǎng)基.D：NirenbergSNA培養(yǎng)基.E：分生孢子.F：厚垣孢子.G、H：分生孢Figure2MorphologicalcharacteristicsofTrichodermaobovatum,Trichodermalongibrachiatum,TrichodermaorientaleandTrichodermaatroviride.A:CMDmedium.B:MEAmedium.C:PDAmedium.D:NirenbergSNAmedium.E:Conidia.F:Chlamydospores.G,H:Conidiophoresandphialides.Bar:10μm.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2868微生物學(xué)通報(bào)Micro圖3基于多基因序列(ITS、rpb2和tef1)構(gòu)建的木霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹分支上的數(shù)字表示自展支持率，只顯示自展支持率大于50%的值.比例尺0.1表示100個(gè)核苷酸中有10個(gè)被替換.括號(hào)內(nèi)表示GenBank登錄號(hào).兩條斜線表示一些分支為適合排版而進(jìn)行縮短，斜線旁邊標(biāo)注分支縮短的倍數(shù)Figure3PhylogenetictreeofinferredfromTrichodermacombinedITS,rpb2andtef1.Numbersabovebranchesarebootstrapvalues,onlyvaluesabove50%areindicated.Thetreescale0.1,representedtenoutof100nucleotideswerereplaced.TheparenthesesrepresenttheGenBankloginnumber.Twodiagonallinesindicatedsomebrancheswereshortenedtofitthemtothepage,thenumberoftimesabranchwasshortenedindicatednexttothelines.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2869 表3本研究分離的木霉菌株在GenBank的登錄號(hào)Table3TrichodermastrainsisolatedinthisstudyandtheiraccessnumberinGenBank分離株Strains菌株編號(hào)StrainNo.rpb2tef1ITST.afroharzianuma69a77a78a80a90a91a92a93a98E708E873E874H23a124a141ON934370ON934371ON934372ON934373ON934374ON934375ON934376ON934377ON934378ON934400ON934401ON934402ON934403ON934383ON934384ON934387ON934335ON934336ON934337ON934338ON934339ON934340ON934341ON934342ON934343ON934365ON934366ON934367ON934368ON934348ON934349ON934352ON844145ON844146ON844147ON844148ON844149ON844150ON844151ON844152ON844153ON844174ON844175ON844176ON844178ON844158ON844159ON844162T.asperelloidesa67a102a103a104a105ON934369ON934379ON934380ON934381ON934382ON934334ON934344ON934345ON934346ON934347ON844144ON844154ON844155ON844156ON844157T.amoenuma126ON934385ON934350ON844160T.paratroviridea131ON934386ON934351ON844161T.obovatumE94E95ON934389ON934390ON934354ON934355ON844163ON844164T.longibrachiatumE105E106E356E357E473D612E475ON934391ON934392ON934395ON934396ON934397ON934388ON934398ON934356ON934357ON934360ON934361ON934362ON934353ON934363ON844165ON844166ON844169ON844170ON844171ON844177ON844172T.orientaleE225E589ON934393ON934399ON934358ON934364ON844167ON844173T.atrovirideE339ON934394ON934359ON844168TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2870微生物學(xué)通報(bào)Microbiol.chinaTelE-mai：tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2871 表5對(duì)危害真菌抑菌效果最明顯的2個(gè)菌株及其抑菌率Table5Thetwostrainswiththemostobviousantagonismeffectondeleteriousfungiandtheirinhibitionrate危害真菌菌株1抑制率菌株2抑制率DeleteriousfungiStrain1InhibitionrateStrain2Inhibitionrate鏈格孢A.alternataT.afroharzianuma9178.2±2.3T.afroharzianuma12475.6±3.2串珠鐮孢F.verticillioidesT.paratroviridea13174.9±3.4T.afroharzianuma9873.2±4.1禾谷鐮孢F.graminearumT.afroharzianuma9179.9±4.4T.afroharzianumE87477.3±0.8層出鐮孢F.proliferatumT.afroharzianuma9171.2±6.4T.afroharzianumE87466.7±1.1黃曲霉A.flavusT.afroharzianuma9181.9±4.9T.afroharzianuma9873.3±2.6黑曲霉A.nigerT.afroharzianuma9166.3±4.0T.afroharzianuma9865.3±3.1粉紅單端孢霉T.roseumT.afroharzianuma9180.4±1.8T.afroharzianumE87478.0±1.0澳大利亞彎孢C.australiensisT.afroharzianuma9168.4±2.4T.afroharzianuma12461.5±3.1新月彎孢C.lunataT.afroharzianuma6977.0±3.6T.afroharzianuma9173.9±2.1卷枝毛霉M.circinelloidesT.paratroviridea13168.9±3.1T.longibrachiatumE47562.7±2.7圖4抑菌效果最好的木霉菌株與不同危害真菌的平板對(duì)峙A–J：危害真菌陰性對(duì)照，鏈格孢、串珠鐮孢、禾谷鐮孢、層出鐮孢、黃曲霉、粉紅單端孢霉、澳大利亞彎孢、黑曲霉、新月彎孢和卷枝毛霉.K–T：對(duì)危害真菌抑菌效果最明顯的木霉屬菌株的平板對(duì)峙，順序同上Figure4PlateconfrontationofTrichodermastrainswiththebestinhibitionanddifferentdeleteriousfungalspecies.A–J:Deleteriousfungiasnegativecontrol,Alternariaalternata,Fusariumverticillioides,Fusariumgraminearum,Fusariumproliferatum,Aspergillusflavus,Trichodermaroseum,Curvulariaaustraliensis,Aspergillusniger,CurvularialunataandMucorcircinelloides.K–T:PlateconfrontationofTrichodermastrainswiththemostobviousantagonismeffectondeleteriousfungi,theorderasabove.2.3.2木霉菌對(duì)危害真菌抑菌效果的顯微觀察由上述分析可知，在對(duì)峙培養(yǎng)條件下，當(dāng)木霉菌的菌絲體和危害真菌的菌絲體相互接觸時(shí)，由于木霉的菌落生長快，很快將危害真菌的菌絲體覆蓋，對(duì)危害真菌產(chǎn)生抑制或拮抗作用，使危害真菌的生長明顯受到抑制。將對(duì)峙生長的平板菌落進(jìn)行顯微觀察，由圖5A–5D可以觀察到危害真菌的菌絲逐步降解為碎片狀，圖5E–5G展示了菌絲降解消融的狀況，由圖5H–5J可觀察到危害真菌的菌絲隔膜處會(huì)逐步發(fā)生溶解和斷裂情況，圖5K–5M可觀察到木霉菌菌絲體通過接觸危害真菌的菌絲體并對(duì)其纏繞，圖5N–5P展示了木霉菌菌絲體穿透危害真菌的菌絲體并在其菌絲內(nèi)寄生，圖5A、5E、5H為危害真菌菌絲的正常狀態(tài)。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2872微生物學(xué)通報(bào)Micro插入危害菌的菌絲.黑色空心箭頭指向危害真菌的菌絲，黑色實(shí)心箭頭指向木霉菌的菌絲.標(biāo)尺=10μmFigure5MicrostructuralobservationontheinhibitionofTrichodermaspp.ondeleteriousfungalspeciesunderconfrontationculture.A–P:HyphaeofTrichodermalysed,twinedandinsertedintothehyphaeofdeleteriousfungi.HollowblackarrowindicateshyphaeofTrichodermaspp.,filledblackarrowindicateshyphaeofdeleteriousfungi.Bar=10μm.3討論與結(jié)論木霉是植物病害生物防治中研究和應(yīng)用非常廣泛的一類真菌。因其具有良好的抑菌性能，屬內(nèi)已有部分菌種作為生物農(nóng)藥或者生物肥料商業(yè)化，廣泛應(yīng)用于植物病原菌的防治[13]，但它們的廣泛應(yīng)用仍受田間條件下生物因素(目標(biāo)植物、病原體、宿主范圍和區(qū)域分布等)和非生物因素(干旱、溫度、濕度、化學(xué)殘留和土壤肥力等)的影響，防治功效受阻礙[14]。因此，從糧食籽粒上分離適于糧食種植的生防木霉菌，對(duì)其在糧食上產(chǎn)毒真菌和病原真菌生物防治方面的應(yīng)用和推廣具有重要意義。木霉屬內(nèi)不同物種的生防功能與代謝產(chǎn)物TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn 祁智慧等:糧食上木霉菌的分離鑒定及其生防效果2873 都不相同[15]，在研究木霉菌株生防潛力之前需對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定，以免造成混淆以及在制劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生不必要的干擾[16]。根據(jù)近幾年文獻(xiàn)報(bào)道，木霉屬的物種鑒定通常選擇ITS、rpb2和tef1等基因片段，結(jié)合數(shù)據(jù)庫已有的標(biāo)準(zhǔn)序列片段進(jìn)行分析，可區(qū)分其種內(nèi)與種間序列差異，避免部分種的錯(cuò)誤鑒定[10,17]。本研究通過對(duì)小麥、稻谷和玉米籽粒上木霉菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，篩選出35株木霉，通過形態(tài)學(xué)和ITS-rpb2-tef1多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，確定糧食籽粒上分到的木霉菌為8個(gè)種。說明木霉菌株可以定殖于糧食籽等[18]的報(bào)道一致。國內(nèi)外大量的研究結(jié)果表明，木霉的抑菌作用具有廣譜性及多種拮抗機(jī)制并存等優(yōu)勢[19]。本試驗(yàn)同時(shí)針對(duì)糧食上常見的10種危害真菌(包括產(chǎn)毒真菌和病原真菌)，采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗?jié)摿Φ臏y定，發(fā)現(xiàn)糧食上分離的木霉屬菌株對(duì)這10種危害真菌均具有抑制作用。由于不同的病原菌菌絲生長能力與產(chǎn)孢時(shí)間不同，同一木霉菌株對(duì)不同危害真菌的抑菌效果不同，而不同的木霉菌物種或同一物種的不同分離株對(duì)于同一種真菌的抑菌效果也不同[20]。Sharma等[21]研究了哈茨木霉ThHP-3對(duì)4種病原真菌的拮抗機(jī)理，發(fā)現(xiàn)木霉在與不同宿主相互作用的不同階段表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄組學(xué)反應(yīng)，證實(shí)木霉菌株對(duì)病原真菌的拮抗作用具有宿主特異性。本次測試的8種木霉中，非洲哈茨木霉和長枝木霉對(duì)于糧食上危害真菌的總體抑菌效果較好，抑菌譜廣。其中非洲哈茨木霉a91對(duì)9種危害菌的抑菌率達(dá)到65%以上，而同一菌種不同菌株的抑菌效果存在較大差異，抑菌率相差5%–20%，這與前人的研究結(jié)果[20]一致。分離株獲取的糧食籽粒來源不同，生存環(huán)境及共生菌群不同，可能會(huì)影響菌株的代謝途徑，進(jìn)而影響其抑菌效果。通過對(duì)木霉菌菌絲與危害菌菌絲交界處顯微觀察發(fā)現(xiàn)，有些木霉菌株和危害真菌的菌絲會(huì)發(fā)生纏繞、穿透入侵的現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道中提到的重寄生現(xiàn)象[22]一致，有些木霉菌株的菌絲會(huì)使危害真菌的菌絲發(fā)生融斷或消解。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是木霉在代謝過程中產(chǎn)生了抑制病原菌的拮抗性物質(zhì)，如木霉素、膠霉素、綠木霉素、抗菌肽等，從而造成了危害真菌菌絲的斷裂解體[23]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，非洲哈茨木霉對(duì)于多種植物病原菌均具有抑制作用[24]。Khruengsai等[25]研究發(fā)現(xiàn)非洲哈茨木霉產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物對(duì)尖孢鐮孢(F.oxysporum)和層出鐮孢具有很強(qiáng)的抗菌活性，我們篩查的抑菌效果最佳的非洲哈茨木霉菌株在顯微鏡下能觀察到明顯的菌絲纏繞和菌絲溶解的結(jié)構(gòu)，推測其具有多重抑菌機(jī)制，具體哪種機(jī)制發(fā)揮主要作用還有待進(jìn)一步研究確定。本研究發(fā)現(xiàn)個(gè)別木霉菌株的抑菌效果明顯且抑菌譜廣，具有開發(fā)糧食產(chǎn)毒真菌和病原菌生物防菌劑的潛力。木霉可通過種子處理，或通過菌絲體制劑、分生孢子制劑和厚垣孢子制劑施拌到土壤中，發(fā)揮抑制病原菌的作用[14]。但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，抑菌效果及以何種抑制機(jī)制為主還有待于深入研究。此外，實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境情況復(fù)雜，木霉的定殖能力和生存能力會(huì)受到影響，其生防效果存在不穩(wěn)定性，不同木霉菌株的組合或與其他微生物群體構(gòu)建復(fù)合菌群有助于提高菌株目標(biāo)生防的生存能力和穩(wěn)定性[26]，這也是我們今后研究關(guān)注的重點(diǎn)問題。木霉絕大多數(shù)對(duì)人類無害，但有些種類能夠感染人類造成木霉病，所以篩選到的木霉菌株的安全性問題也需進(jìn)行確認(rèn)[27]。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2874微生物學(xué)通報(bào)MicroREFERENCES[1]SCHIROG,MüLLERT,VERCHG,SOMMERFELDT,MAUCHT,KOCHM,GRIMMV,MüLLERMEH.Thedistributionofmycotoxinsinaheterogeneouswheatfieldinrelationtomicroclimate,fungalandbacterialabundance[J].JournalofAppliedMicrobiology,2019,126(1):177-190.[2]ST?PIE??,CHE?KOWSKIJ.Fusariumheadblightofwheat:pathogenicspeciesandtheirmycotoxins[J].WorldMycotoxinJournal,2010,3:107-119.[3]FILIZOLAPRB,LUNAMAC,deSOUZAAF,COELHOIL,LARANJEIRAD,CAMPOS-TAKAKIGM.BiodiversityandphylogenyofnovelTrichodermaisolatesfrommangrovesedimentsandpotentialofbiocontrolagainstFusariumstrains[J].MicrobialCellFactories,2019,18(1):89.[4]THAMBUGALAKM,DARANAGAMADA,PHILLIPSAJL,KANNANGARASD,PROMPUTTHAI.Fungivs.fungiinbiocontrol:anoverviewoffungalantagonistsappliedagainstfungalplantpathogens[J].FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology,2020,10:604923.[5]CARRO-HUERGAG,MAYO-PRIETOS,RODRíGUEZ-GONZáLEZá,GONZáLEZ-LóPEZó,GUTIéRREZS,CASQUEROPA.InfluenceoffungicideapplicationandvineageonTrichodermadiversityassourceofbiologicalcontrolagents[J].Agronomy,2021,11(3):446.[6]WOOSL,RUOCCOM,VINALEF,NIGROM,MARRAR,LOMBARDIN,PASCALEA,LANZUISES,MANGANIELLOG,LORITOM.Trichoderma-basedproductsandtheirwidespreaduseinagriculture[J].TheOpenMycologyJournal,2014,8(1):71-126.[7]ALFIKYA,WEISSKOPFL.DecipheringTrichoderma-plant-pathogeninteractionsforbetterdevelopmentofbiocontrolapplications[J].JournalofFungi(Basel,Switzerland),2021,7(1):61.[8]HEAL,SUNJN,WANGXH,ZOULW,FUB,CHENJ.ReprogrammedendophyticmicrobialcommunityinmaizestalkinducedbybiocontrolagentagainstFusariumdiseasesandmycotoxinaccumulation[J].FungalBiology,2019,123(6):[9]SWAINH,ADAKT,MUKHERJEEAK,MUKHERJEEPK,BHATTACHARYYAP,BEHERAS,BAGCHITB,PATROR,SHASMITA,KHANDUALA,BAGMK,DANGARTK,LENKAS,JENAM.NovelTrichodermastrainsisolatedfromtreebarksaspotentialbiocontrolagentsandbiofertilizersfordirectseededrice[J].MicrobiologicalResearch,2018,214:83-90.[10]INGLISPW,MELLOSCM,MARTINSI,SILVAJBT,MACêDOK,SIFUENTESDN,VALADARES-INGLISMC.TrichodermafromBraziliangarlicandonioncropsoilsanddescriptionoftwonewspecies:TrichodermaazevedoiandTrichodermapeberdyi[J].PLoSOne,2020,15(3):e0228485.[11]JAKLITSCHWM,VOGLMAYRH.BiodiversityofTrichoderma(Hypocreaceae)inSouthernEuropeandMacaronesia[J].StudiesinMycology,2015,80:1-87.[12]KATSURAYAMAAM,MARTINSLM,IAMANAKABT,FUNGAROMHP,SILVAJJ,PITTJI,FRISVADJC,TANIWAKIMH.FungalcommunitiesinricecultivatedindifferentBrazilianagroclimaticzones:fromfieldtomarket[J].FoodMicrobiology,2020,87:103378.[13]OLIVEIRACM,ALMEIDANO,CORTESMV,JUNIORML,daROCHAMR,ULHOAC.BiologicalcontrolofPratylenchusbrachyuruswithisolatesofTrichodermaspp.onsoybean[J].BiologicalControl,2021,152:104425.[14]FERREIRAFV,MUSUMECIMA.Trichodermaasbiologicalcontrolagent:scopeandprospectstoimproveefficacy[J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2021,37(5):90.[15]SUNJZ,PEIYF,LIEW,LIW,HYDEKD,YINWB,LIUXZ.AnewspeciesofTrichodermahypoxylonharboursabundantsecondarymetabolites[J].ScientificReports,2016,6:37369.[16]朱兆香,莊文穎.木霉屬研究概況[J].菌物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