基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

近幾年來(lái),隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,將納米顆粒的制備技術(shù)引入殼聚糖-蛋白質(zhì)藥物載體的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸成為人們的研究熱點(diǎn).基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,是地球上僅次于纖維素的最為豐富的天然高分子化合物,其化學(xué)名稱為聚2-氨基-

2-脫氧-β-葡萄糖,是由N-乙酰氨基葡萄糖以α-1,4糖苷鍵縮合而成,是一種天然聚陽(yáng)離子堿性多糖.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

殼聚糖是一種用途很廣的天然高分子化合物,具有無(wú)毒、生物相容性、吸附功能、生物可降解性及多種生物學(xué)活性等優(yōu)異性能.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米本文思路：

采用基于殼聚糖(CS)與聚陰離子(多聚磷酸納)間靜電作用的離子凝膠化方法,以牛血清白蛋白(BSA)為模型,在室溫下制備了包載蛋白質(zhì)的親水性殼聚糖納米顆粒.對(duì)BSA-殼聚糖納米顆粒的形成條件進(jìn)行了考察,結(jié)果表明:在pH值為5.0,CS與TPP的質(zhì)量比為4,殼聚糖分子量為400kDa的最優(yōu)化的條件下可制備粒徑小于100nm的BSA-殼聚糖納米顆粒,對(duì)BSA的包封率達(dá)到50%以上.并將該體系初步應(yīng)用于蛋白類(lèi)藥物丙種球蛋白-殼聚糖納米顆粒的制備研究,這種殼聚糖納米顆粒對(duì)丙種球蛋白具有良好的緩釋作用.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米1、實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑及儀器殼聚糖,Fluka公司;BCA蛋白質(zhì)試劑盒,美國(guó)Pierce公司;牛血清白蛋白,上海伯奧科技有限公司;丙種球蛋白,南京軍區(qū)生物制品藥物研究所;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米SPA-400原子力顯微鏡,日本精工公司;3000HS激光粒度分析儀,英國(guó)Malvern公司;CR22G高速冷凍離心機(jī),日本日立公司.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1BSA殼聚糖納米顆粒的制備及影響

因素的考察

先將殼聚糖溶解到HAC-NaAC緩沖溶液中,在磁力攪拌下,將一定體積溶有BSA的TPP溶液滴加到殼聚糖溶液中,室溫下反應(yīng)3h后即可.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

改變緩沖溶液的pH值、CS及TPP的質(zhì)量比以及選用不同分子量的殼聚糖制備BSA-殼聚糖納米顆粒(CS-BSA-TPP),在激光粒度分析儀上測(cè)定不同條件下顆粒的平均粒徑,分別考察上述條件對(duì)納米顆粒粒徑的影響.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米1.2.2BSA-殼聚糖納米顆粒的表征

根據(jù)粒徑的最佳條件制備CS-BSA-TPP

納米顆粒,取適量產(chǎn)品溶液滴于云母片上,

自然干燥后通過(guò)原子力顯微鏡觀測(cè)納米顆

粒的直觀形貌圖.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米1.2.3BSA包封率的測(cè)定按上述最佳條件制備CS-BSA-TPP納米顆粒及未包載BSA的空白納米顆粒(CS-TPP),取適量產(chǎn)品溶液在10℃下超速離心(26000r/min)30min,量取適量上清液,按照BCA蛋白質(zhì)試劑盒提供的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

測(cè)定上清液中BSA的濃度,根據(jù)下列公式求出BSA的包封率:

A.E.%=[(m-m1)/m]100%.式中:m為BSA總量;m1為上清液中BSA的含量.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米2、結(jié)果與討論基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米2.1CS與TPP質(zhì)量比對(duì)顆粒粒徑的影響

改變CS與TPP的質(zhì)量比(mcs/mTPP),分別測(cè)定不同條件下CS-BSA-TPP納米顆粒的粒徑,當(dāng)mcs/mTPP值在3~8之間時(shí),顆粒的平均粒徑處于80~250nm之間,其中以mcs/mTPP為4：1時(shí)粒徑最小;而mcs/mTPP值低于3及高于10以后,得到的是微米顆粒.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米當(dāng)pH值大于4之后其粒徑迅速減小.當(dāng)pH值為5.0時(shí),CS-BSA-TPP納米顆粒的粒徑最小.2.2pH值對(duì)顆粒粒徑的影響

原因：由于CS表面帶正電荷,而TPP是帶負(fù)電荷的多聚陰離子,二者基于靜電作用形成球珠狀凝膠,BSA可被包裹進(jìn)其交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)骨架內(nèi).當(dāng)pH值接近或超過(guò)BSA的等點(diǎn)電時(shí),TPP及BSA表面所帶負(fù)電荷較多,更易于與帶正電荷的CS交聯(lián),因而形成的納米顆粒很緊密,粒徑很小.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

由此可見(jiàn),在pH值為5.0的HAC-NaAC緩沖溶液中制備的殼聚糖納米顆粒平均粒徑最小,穩(wěn)定性好.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米固定pH值為5.0,CS與TPP的質(zhì)量比為4：1,制備3種分子量的CS-BSA-TPP納米顆粒.最小2.3殼聚糖分子量對(duì)顆粒粒徑的影響結(jié)果見(jiàn)圖3,分子量分別為300kDa及400kDa時(shí),顆粒的粒徑小于200nm,而分子量為400kDa時(shí)最小.當(dāng)殼聚糖分子量增大為600kDa時(shí),產(chǎn)生的顆粒尺寸大于500nm.進(jìn)一步比較了3種殼聚糖納米顆粒所包載BSA的包封率,發(fā)現(xiàn)2種大分子量的殼聚糖包封率均比較高.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米原因：殼聚糖自身具備高聚物的結(jié)構(gòu)特征,分子量越大其聚合度越大,越有利于與聚陰離子形成聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò),能被這種聚合物交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)包裹進(jìn)去的BSA的量也越多.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

因此,綜合考慮包封率和顆粒大小,我們選擇分子量為400kDa的殼聚糖作為藥物的合適載體.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米2.4BSA-殼聚糖納米顆粒的表征

如圖4所示,BSA-殼聚糖納米顆粒呈球形,粒徑分布在50~100nm之間.同時(shí)利用激光粒度分析儀對(duì)納米顆粒的粒徑進(jìn)行動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì),根據(jù)粒徑的數(shù)量分布顯示,99.4%的納米顆粒的粒徑為(67.0±24.3)nm,與原子力顯微鏡的觀測(cè)結(jié)果基本吻合.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米2.5殼聚糖納米顆粒在丙種球蛋白納米藥物載體制備中的初步應(yīng)用

固定CS與TPP的質(zhì)量比為4:1,在pH值為5.0的條件下,選擇分子量為400kDa的殼聚糖,制備包載丙種球蛋白的殼聚糖納米顆粒.結(jié)果表明:制備的納米顆粒平均粒徑在50~100nm之間,包封率為55.0%.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米

同時(shí),為進(jìn)一步考察該納米顆粒能否實(shí)現(xiàn)丙種球蛋白的釋放,初步探討了其在PBS中的體外釋放特征,結(jié)果如圖5所示.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米在釋藥初期(1~2d內(nèi)),大約釋放20%的丙種球蛋白,在隨后幾天內(nèi),釋放度一直趨于平緩,到第10天釋放度達(dá)到52.5%.結(jié)果顯示,該殼聚糖納米顆粒對(duì)丙種球蛋白具有良好的緩釋作用.基于殼聚糖載體的蛋白質(zhì)藥物納米3、結(jié)論本法不但實(shí)驗(yàn)條件溫和,不需要有機(jī)溶劑及戊二醛等交聯(lián)劑,可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室大量制備大小均勻、分散性好、性質(zhì)穩(wěn)定的包載蛋白質(zhì)藥物的殼聚糖納米顆