高中生物重點講解多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件

高中生物重點講解多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件課標領航1．嘗試PCR(DNA多聚酶鏈式反應)技術的基本操作。2．理解PCR的原理和反應過程。3．討論PCR的應用?！局攸c】

PCR的原理和反應過程?！倦y點】

PCR技術的操作過程。情境導引PCR診斷技術又叫多聚酶,鏈式反應技術，它采用分子技術,模擬核酸在體內(nèi)的復制，從而判,定疾病病原體的種類，所以從本,質(zhì)上來說，這是一種分子診斷方法?；A自主梳理一、PCR擴增的原理及條件1．概念：PCR即_______________，是一種體外迅速擴增DNA片段的技術。它能以極少量的_____為模板，在短時間內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。2．原理(1)DNA的熱變性：在80～100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA_________結構解體，雙鏈分開，這個過程稱為_____。當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結合成雙鏈。多聚酶鏈式反應DNA雙螺旋變性(2)子鏈的合成：①需要______；②合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。3．條件(1)______模板。(2)分別與模板DNA兩條鏈相結合的兩種引物。(3)A、T、G、C四種______________。(4)耐熱的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要穩(wěn)定的_____和能嚴格控制_____的溫控設備.引物DNA脫氧核苷酸pH溫度思考感悟

1．什么是引物？若要克隆DNA，應加入幾種特定的引物？【提示】所謂引物是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA片段。DNA是由兩條反向平行排列的脫氧核苷酸長鏈構成的。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。二、PCR反應過程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為____、復性和延伸三步。1．變性：當溫度上升到______以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈。2．復性：溫度下降到_______左右，兩種引物通過________________與兩條單鏈DNA結合。3．延伸：溫度上升到_____左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在_______________的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。變性90℃50℃堿基互補配對72℃DNA聚合酶思考感悟

2．PCR循環(huán)過程中，變性溫度設置95℃，時間設置30s的原因是什么？【提示】變性溫度過低，解鏈不完全導致DNA不能擴增。變性溫度過高影響酶的活性；在此溫度條件下如果處理時間過長，將會導致酶的鈍化。三、實驗操作1．實驗用具(1)PCR儀：該儀器能自動調(diào)控_____，實現(xiàn)DNA的擴增。如果沒有PCR儀，可用3個___________代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應的微量離心管。(2)微量離心管：總?cè)莘e為0.5mL，實際上是進行離心的場所。(3)微量移液器：用于吸取轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭每吸取一種試劑后都要更換。溫度恒溫水浴鍋2．操作步驟準備→____→混合→_____→反應。

四、操作提示1．為避免外源DNA等因素的污染，實驗中使用的一些用具在使用前必須進行__________。2．所用的_________和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。五、DNA含量的測定1．原理：利用DNA在260nm的紫外線波段的______曲線來測定相應含量。2．計算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的讀數(shù))×_____________。移液離心高壓滅菌緩沖液吸收稀釋倍數(shù)核心要點突破要點一PCR原理1．PCR擴增方向：為了明確地表示DNA的方向，通常將DNA的羥基(—OH)末端稱為3′端，而磷酸基團的末端稱為5′端。DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，即DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。2．PCR原理——DNA的熱變性原理

通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動控制溫度的儀器。3．生物體內(nèi)DNA復制與PCR反應的區(qū)別體內(nèi)復制PCR反應解旋在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分解開加熱至90℃以上時，雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或單鏈DNA分子片段合成子鏈在引物基礎上，一條鏈連續(xù)合成，另一條鏈不連續(xù)合成分別從兩條鏈的引物端開始，都是連續(xù)合成，控制溫度72℃特點邊解旋邊復制，半保留復制體外迅速擴增TaqDNA聚合酶不需要需要循環(huán)次數(shù)受生物體自身控制30多次相同點生物體內(nèi)的DNA復制和PCR體外DNA擴增都需要模板、四種脫氧核苷酸，且都需要在一定的緩沖溶液中進行 (2011年聊城高二檢測)下列關于DNA復制和PCR的描述中，正確的是(

)A．DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5′端延伸DNA鏈B．DNA復制不需要引物C．引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結合D．PCR擴增的對象是氨基酸序列【嘗試解答】

__C__例1【解析】由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3′端延伸DNA鏈，故DNA復制需要引物，而且它與DNA母鏈通過堿基互補配對結合。PCR擴增的對象是DNA，而不是氨基酸?！咎揭?guī)尋律】

(1)引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ兩種。用于PCR的引物長度通常為20～30個核苷酸。(2)細胞內(nèi)DNA復制與PCR技術的原理和過程容易發(fā)生混淆，特別應注意區(qū)分PCR反應需要可變的溫度，而體內(nèi)DNA復制需要穩(wěn)定的溫度。跟蹤訓練(2011年海淀區(qū)高二檢測)關于DNA片段PCR擴增實驗的描述中不正確的是(

)A．加入的TaqDNA聚合酶耐高溫B．不同大小DNA在電場中遷移速率不同C．此過程需要DNA連接酶D．擴增區(qū)域由兩種引物來決定解析：選C。PCR擴增實驗是在較高溫度下進行的，故需要耐高溫的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA連接酶，A項正確，C項錯誤。因為不同大小的DNA帶有不同數(shù)量的電荷，所以在電場中遷移速率不同，B項正確。PCR擴增需要兩種引物，分別與DNA的兩條模板鏈互補，則D項正確。要點二PCR反應的實驗操作過程1．反應體系的配方10倍濃縮的擴增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶1～2U模板DNA5～10μL注：①總體積50μL，②模板DNA的用量在1pg～1mg之間2.實驗用具(1)PCR儀：PCR自動化程度較高，參照下表設計程序即可。循環(huán)數(shù)變性復性延伸預變性94℃，5min－－30次94℃，30s

55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min若無PCR儀，可用恒溫水浴鍋代替，三個恒溫水浴鍋的溫度分別為94℃、55℃和72℃，然后按照上表要求，在三個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反應的微量離心管。(2)微量離心管：一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5mL。(3)微量移液器：用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。3．實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需試劑擺放在實驗桌上?用微量移液器按照配方在微量試管中依次加入各組分?蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁?將微量離心管放在離心機上，離心約10min?將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序 (2011年長春高二檢測)多聚酶鏈式反應(PCR技術)是在實驗室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術，反應系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸等。反應中新合成的DNA又可以作為下一輪反應的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴增，其簡要過程如圖所示。例2(1)某個DNA樣品有1000個脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A∶G∶T∶C＝1∶2∶3∶4，則經(jīng)過PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生________個DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是________個。(2)分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個新DNA之間存在差異，這些差異是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)由于DNA分子上的“遺傳因子”基本都是符合孟德爾的遺傳規(guī)律的，因此人類可以利用PCR技術合成的DNA進行親子鑒定，其原理是：首先獲取被測試者的DNA，并進行PCR擴增，取其中一樣本DNA用限制性核酸內(nèi)切酶切成特定的小片段，放進凝膠內(nèi)，用電泳推動DNA小片段分離，再使用特別的“探針”去尋找基因。相同的基因會凝聚在一起，然后利用特別的染料在X光下，便會顯示由DNA探針凝聚于一起的黑色條碼。每個人的條碼一半與其母親的條碼吻合，另一半與其父親的條碼吻合。①限制性核酸內(nèi)切酶能將DNA樣品切成特定的小片段，這主要體現(xiàn)了酶的________。A．專一性 B．高效性C．多樣性

D．作用條件溫和②2002年6月，我國第一張18位點的“基因身份證明”在湖北武漢誕生。人的“基因身份證明”是否終身有效？________，理由是___________________________________________________________________________________。(4)請指出PCR技術與轉(zhuǎn)錄過程的三個不同之處：①________________________________________________________________________；②________________________________________________________________________；③________________________________________________________________________?！緡L試解答】

(1)32

6200(2)堿基(脫氧核苷酸)的數(shù)目、比例和排列順序不同(3)①A②是因為同一個體的不同生長發(fā)育階段和不同組織的DNA是相同的，所以它有高度的個體特異性和穩(wěn)定性(4)①PCR技術以DNA的兩條單鏈為模板合成子代DNA，轉(zhuǎn)錄以DNA的一條單鏈為模板合成RNA②PCR技術的原料為脫氧核苷酸，轉(zhuǎn)錄的原料是核糖核苷酸③二者反應時的催化酶不同(或其他合理答案)【解析】本題考查了PCR技術的應用及相關計算與識圖能力。(1)該DNA樣品復制5次，產(chǎn)生DNA分子數(shù)為25＝32個，DNA樣品中T＝A＝200個，則樣品復制5次，需要胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少為200×(25－1)＝6200個。(2)不同生物的DNA樣品中，脫氧核苷酸(堿基)數(shù)目、比例和排