2023學年完整公開課版示范課PCR

聚合酶鏈式反應PCR:PolymeraseChainReaction浠水一中陳旭學習目標掌握PCR技術的反應條件和反應過程二理解PCR的基本原理一了解PCR技術的產(chǎn)生、發(fā)展和應用三重點：PCR的原理和條件一難點：PCR的原理二重難點PCR技術多聚酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。這項技術有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，被廣泛地應用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等各方面。內(nèi)容條件細胞內(nèi)的DNA復制需要哪些條件？解旋酶、DNA聚合酶等DNA的兩條鏈4種脫氧核苷酸？酶（催化解旋、聚合等）模板原料能量DNA復制作用細胞內(nèi)的DNA復制需要哪些條件？解旋酶+能量DNA母鏈DNA聚合酶4種脫氧核苷酸(dNTP)dNTP引物打開DNA雙鏈做為模板催化合成DNA子鏈合成子鏈的原料提供聚合反應所需的能量使DNA聚合酶能夠從引物的3’末端開始連接脫氧核苷酸？？作為體外模擬DNA復制的PCR技術，是如何模擬的呢？DNA復制解旋酶+能量DNA母鏈DNA聚合酶4種脫氧核苷酸(dNTP)小段RNA，由引物酶合成PCR加熱（90～95℃）DNA母鏈耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）4種脫氧核苷酸(dNTP)小段DNA，一般由化學法人工合成作用打開DNA雙鏈做為模板催化合成DNA子鏈作為原料及供能作為引物????PCR是對DNA復制的體外模擬1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，所以，Khorana的設想被人們遺忘了。但這個設想被Sanger等用于DNA測序，并獲得了1980年諾貝爾化學獎。PCR技術發(fā)展簡史1983年，在Cetus公司工作的穆利斯（Mullis）突然萌發(fā)了一個想法：如果用兩條引物同時擴增模板DNA的兩條鏈，那么一生二、二生四、四變無窮……這就是聚合酶鏈式反應。PCR技術發(fā)展簡史95℃變性50-65℃退火XX℃延伸95℃（變性）55℃（復性/退火）37℃(延伸)加入大腸桿菌DNA聚合酶PCR循環(huán)這是個勞動密集型的工作，不僅繁瑣，而且昂貴使PCR真正廣泛應用的，是耐高溫的DNA聚合酶的使用我國臺灣的科學家錢嘉韻第一個報道分離出了耐高溫DNA聚合酶1973年，錢嘉韻在美國辛辛那提大學生物系時，首次從美國黃石公園熱泉里的嗜熱菌Taq菌中分離了耐高溫的TaqDNA聚合酶，并于1976年發(fā)表這一成果。TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)40506070809010010080604020熱泉的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而使耐熱的Taq菌脫穎而出。高溫條件選擇了Taq菌，Taq菌選擇了耐熱的Taq酶。問題：為什么能夠很快從熱泉中的Taq菌里發(fā)現(xiàn)耐熱的DNA聚合酶呢？為什么大腸桿菌里沒有耐熱的DNA聚合酶？95℃（變性）55℃（復性/退火）72℃(延伸)TaqDNA聚合酶PCR循環(huán)1986年春，Mullis首次提出耐高溫酶的使用；

同年6月，Cetus公司首度將Taq酶應用于PCR，大獲成功1988年，第一臺PCR儀（即熱循環(huán)儀）問世1993年穆利斯PCR獲得諾貝爾化學獎PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火55?C25～35輪預變性95?C5minDNA復制解旋酶+能量DNA母鏈DNA聚合酶4種脫氧核苷酸(dNTP)小段RNA，由引物酶合成PCR加熱（90～95℃）DNA母鏈耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）4種脫氧核苷酸(dNTP)小段DNA，一般由化學法人工合成作用打開DNA雙鏈做為模板催化合成DNA子鏈作為原料及供能作為引物??PCR是對DNA復制的體外模擬PCR反應演示PCR知識總結PCR六要素：模板引物dNTP耐熱DNA聚合酶（Taq酶）緩沖液（含Mg2+）熱循環(huán)裝置（PCR儀）PCR知識總結PCR的實質(zhì)體外模擬的DNA復制PCR的產(chǎn)物兩條引物之間的DNA片段PCR的過程預變性變性復性（退火）延伸當堂訓練1、下列符合PCR反應條件的是（）①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③合成引物④四種脫氧核苷酸⑤DNA聚合酶⑥D(zhuǎn)NA解旋酶⑦限制性內(nèi)切酶⑧溫控設備．A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤⑥⑦⑧C.③④⑤⑥⑦⑧D.①②③④⑤⑧√當堂訓練2、PCR過程與細胞內(nèi)的DNA復制過程相比，主要有兩點不同，它們是（）①PCR過程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或RNA；②PCR過程不需要DNA聚合酶；③PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的；④PCR過程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板進行復制．A.③④B.①②C.①③D.②④√當堂訓練PCR是一種體外快速擴增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個。PCR需要模板DNA、引物、脫氧核苷酸和DNA聚合酶等條件。下圖為模板DNA分子及2種引物，請回答相關問題。(1)PCR的全稱是________。RCR與體內(nèi)DNA復制的不同之處主要表現(xiàn)在溫度環(huán)境的不同，在PCR技術中先用95℃高溫處理的目的是________，而這一過程在細胞內(nèi)是通過_______________實現(xiàn)的。(2)在PCR技術中所需要的引物實質(zhì)上是一種_________________。請在圖中繪出引物結合的位置。(3)DNA子鏈復制的方向是______________________，這是由于DNA聚合酶只能__________________________________________。(4)若將1個DNA分子拷貝10次，則需要在緩沖液中至少加入________個引物。聚合酶鏈式反應使DNA變性解旋酶的催化單鏈DNA或RNA分子211-2從5’端到3’端從引物的

3′端開始連接單個脫氧核苷酸分子謝謝！dNTPdNTP是脫氧核糖核苷（三磷）酸的縮寫，是包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP在內(nèi)的統(tǒng)稱，N是指含氮堿基，代表A、T、G、C、U等中的一種。dNTP是細胞內(nèi)DNA合成的原料。ATP與dATPdATPATPATP與dATPdATP什么是引物？

為什么DNA合成需要引物呢？這源于DNA的分子結構以及DNA聚合酶的兩個特性1、DNA雙螺旋的兩條單鏈是反向平行的DNA單鏈與肽鏈一樣，兩個末端結構是不一樣的3’端：游離羥基5’端：游離磷酸基團3’端：游離羥基母鏈子鏈5’端5’端3’端3’端2、DNA聚合酶具有兩個特性只能向子鏈的3’端加上游離的脫氧核苷酸，使子鏈的3’端延長,而無法反向聚合不能從頭開始合成DNA，只能從3’端延伸DNA鏈3’端：游離羥基5’端：游離磷酸基團3’端：游離羥基母鏈子鏈2、DNA聚合酶具有兩個特性