枸杞多糖對實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)的影響及其抗腫瘤作用機(jī)制

枸杞多糖對實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)的影響及其抗腫瘤作用機(jī)制【摘要】【目的】觀察枸杞多糖(LBP)對實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞死亡分子Fas配體(FasL)表達(dá)的影響,探討其抗腫瘤作用機(jī)制?！痉椒ā窟x用昆明種小鼠,隨機(jī)分為模型組,LBP低、高劑量組(劑量分別為0625、1250g·kg-1·d-1),各組均采用右側(cè)腋下接種H22肝癌腹水型細(xì)胞復(fù)制荷瘤模型,從第3天開始按設(shè)計(jì)劑量給藥,連續(xù)14d。采用蘇木素—伊紅(HE)染色觀察各組腫瘤細(xì)胞密度、細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)及間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤情況，采用免疫組化法觀察各組小鼠腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】LBP低、高劑量組均可顯著降低腫瘤細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)(P＜005)；LBP高劑量組可升高腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤程度(P＜005),HE染色顯示在腫瘤邊緣組織內(nèi)見多量淋巴細(xì)胞浸潤。LBP低、高劑量組均可顯著降低小鼠腫瘤細(xì)胞FasL陽性表達(dá)指數(shù)(P＜005)；免疫組化染色顯示模型組FasL表達(dá)強(qiáng)陽性,LBP低劑量組部分肝癌細(xì)胞內(nèi)FasL表達(dá)陽性,FasL僅在LBP高劑量組少量肝癌細(xì)胞中有表達(dá)?！窘Y(jié)論】LBP抗實(shí)驗(yàn)性肝癌的效應(yīng)可能與其能抑制FasL表達(dá),減少免疫活性細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】枸杞多糖/藥理學(xué)肝腫瘤/中藥療法腫瘤組織/病理學(xué)基因表達(dá)調(diào)控疾病模型,動物小鼠

Abstract:ObjectiveToobservetheinfluenceofLyciumBarbarumpolysaccharide(LBP)onFasLexpressioninH22bearingmiceandtoexploreitsantitumormechanism.MethodsKunmingmicewererandomizedintothemodelgroup,andlowandhighdoseLBP(inthedoseof0625and1250g·kg-1·d-1respectively)groups.H22bearingmicemodelswereinducedthroughrightsubaxillaryinoculationofH22asciticcells.Threedaysafterinoculation,LBPgroupweregivenLBPfor14days.Hematoxylinandeosin(HE)stainingmethodwasusedtoexaminethetumorcelldensity,tumorcellmitoticcount,andlymphocyteinfiltrationintumorinterstitialtissue.FasLexpressionwasobservedinthethreegroupswithimmunohistochemicalmethod.ResultsTumorcellmitoticcountwasdecreasedinthetwoLBPgroups(P005),thescoreoflymphocyteinfiltrationintumorinterstitialtissuewasincreased,andlymphocyteinfiltrationwasobviousafterHEstaininginhighdoseLBPgroup(P005).TheindexofFasLexpressionpositivewasdecreasedinbothLBPgroups(P005).FasLexpressionwasstrongpositiveinthemodelgroup,andpositiveinpartiallivertumorcellsoflowdoseLBPgroupandinlesslivertumorcellsofhighdoseLBPgroup.ConclusionTheantitumormechanismofLBPisprobablyrelatedwiththeinhibitionofFasLexpressionandwiththesuppressionofapoptosisofimmuneactivelymphocytes．

Keywords:LYCIUMBARBARUMPOLYSACCHARIDE/pharmacology;LIVERNEOPLASMS/TCDtherapy;NEOPLASMS/pathology;GENEEXPRESSIONREGULATION;DISEASEMODELS,ANIMAL;MICE

死亡分子Fas(APO1/CD95)和其配體FasL相互作用是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)FasL,與活化的Fas(+)的淋巴細(xì)胞接觸,主動殺傷免疫活性細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)其免疫逃逸,故又稱為Fas反擊［1-2］。研究證實(shí)枸杞多糖(LBP)具有廣泛的抗腫瘤效應(yīng)［3-4］,本研究通過觀察小鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌組織FasL表達(dá)情況及病理學(xué)改變,探討LBP抗實(shí)驗(yàn)性肝癌作用可能存在的機(jī)制和靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

動物與瘤株昆明種小鼠,清潔級,6～8周齡,體質(zhì)量(18±2)g,雌雄各半,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號：0002769；H22肝癌腹水型細(xì)胞株由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫提供。

藥物與試劑枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所藥物化學(xué)研究室從優(yōu)質(zhì)寧夏枸杞子中分離提取,采用雙光束紫外可見分光光度計(jì)測定LBP含量為358g/kg；兔抗FasL免疫組化試劑為BOSTERBIOTECHNOLOGY公司產(chǎn)品,批號：BA0049；兔多克隆抗體免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SA1022)、二氨基聯(lián)苯胺(3,3′diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；甲醛、乙醇、二甲苯均為汕頭市光華化學(xué)廠產(chǎn)品；石蠟為江蘇太倉皓天石蠟廠產(chǎn)品。

儀器TU1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；LIBRORAEG220電子天平(日本島津)；NEXPOWER1000型純水器(韓國HumanCorp)；TO1020脫水機(jī)、EG1160包埋機(jī)、RM2135輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、ST4040染色機(jī)均購自德國Leica公司；CX21顯微鏡(日本OLYMPUS)。

分組造模及給藥昆明種小鼠45只,隨機(jī)分為3組,每組15只,分別為模型組及LBP低、高劑量組,均于第1天采用右側(cè)腋下接種2×106個H22肝癌腹水型細(xì)胞復(fù)制荷瘤模型。從第3天開始,模型組以05mL/d生理鹽水灌胃,LBP低、高劑量組分別給予LBP0625、1250g·kg·d-1灌胃,連續(xù)14d。枸杞多糖給藥劑量根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果而設(shè)定。

觀察指標(biāo)

腫瘤組織病理學(xué)檢查每天觀察小鼠的毛發(fā)、營養(yǎng)、體質(zhì)量、精神狀況、腫瘤生長及死亡等情況。第15天小鼠脫頸椎處死,腫瘤組織按組排列拍照后,肉眼觀察腫瘤大小、顏色、壞死情況等,切取部分組織用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,蘇木素—伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下對各組腫瘤細(xì)胞密度、細(xì)胞核分裂像計(jì)數(shù)及對間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行半定量分析,由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評分、攝片。具體方法：①腫瘤細(xì)胞密度：每張切片選擇3個高倍鏡非壞死區(qū)域視野綜合判定,分為“密”(+)：腫瘤細(xì)胞聚集成巢，細(xì)胞間隙隨處可見；“很密”(++)：腫瘤細(xì)胞緊密排列成巢，部分區(qū)域見到細(xì)胞間隙；“極密”(+++)：腫瘤細(xì)胞密集成堆,少見細(xì)胞間隙。②腫瘤細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)［6］：每張切片選擇核分裂最多的區(qū)域,連續(xù)計(jì)數(shù)5個高倍鏡不重復(fù)非壞死視野(HP),對核分裂像進(jìn)行計(jì)數(shù),取平均值,計(jì)算出每高倍視野的核分裂計(jì)數(shù)。③腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤程度分級：根據(jù)腫瘤間質(zhì)中淋巴細(xì)胞浸潤情況,分為稀疏散在分布(+)、中量程度浸潤(++)及密布或聚集成團(tuán)(+++)3個等級。

免疫組化法檢測腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)采用鏈酶卵白素辣根過氧化物酶復(fù)合物法(LSAB法),具體操作步驟按照說明書進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽性和陰性對照,陽性對照片為試劑公司提供的乳腺癌組織切片,陰性對照由磷酸鹽緩沖液代替一抗。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜或細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性著色。在高倍鏡視野(×400)下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個視野,記錄陽性細(xì)胞占肝癌細(xì)胞總數(shù)百分比的平均值,即為FasL陽性表達(dá)指數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS115統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。多組計(jì)量資料之間采用單因素方差分析,有序的分類資料采用Ridit分析方法,均數(shù)之間的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

各組腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察情況

腫瘤細(xì)胞密度及細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)各組小鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,H22細(xì)胞腋下接種后第5～6天均能觸及皮下大小不等的腫瘤。腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察顯示：模型組腫瘤細(xì)胞排列緊密,表現(xiàn)出細(xì)胞密度大,形態(tài)異形性明顯；LBP高、低劑量組腫瘤細(xì)胞增殖密度均有不同程度的減小,細(xì)胞仍表現(xiàn)出一定的異形性,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組間無顯著性差異。

高倍鏡下對各組進(jìn)行腫瘤細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)模型組明顯多于LBP高、低劑量組,尤其是在每高倍視野下超過5個核分裂的標(biāo)本較多,且多見病理性核分裂像,呈現(xiàn)不對稱雙極、三極、四極及多極性核分裂和頓挫型核分裂。而LBP高、低劑量組用藥后可顯著降低腫瘤細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù),與模型組比較差異均有顯著性意義(P005)。結(jié)果見表1。表1各組腫瘤細(xì)胞核分裂計(jì)數(shù)比較(略)

腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤情況淋巴細(xì)胞浸潤常出現(xiàn)在腫瘤間質(zhì)及腫瘤與正常組織交界處,模型組有10例標(biāo)本淋巴細(xì)胞浸潤較少,表現(xiàn)為稀疏散在的分布。而LBP高、低劑量組用藥后,在腫瘤間質(zhì)中及腫瘤與正常組織交界處,均可見較明顯的淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,LBP高劑量組在腫瘤邊緣組織內(nèi)可見多量淋巴細(xì)胞浸潤。LBP高劑量組腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤程度分級與模型組比較差異有顯著性意義(P＜005)。結(jié)果見表2、圖1。表2各組腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤程度分級比較

LBP對實(shí)驗(yàn)性肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)的影響圖2結(jié)果顯示：模型組普遍存在FasL表達(dá)強(qiáng)陽性,腫瘤組織中FasL表達(dá)主要在細(xì)胞漿中,部分在細(xì)胞膜；LBP低劑量組部分肝癌細(xì)胞內(nèi)FasL表達(dá)陽性,LBP高劑量組FasL僅在少量腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。LBP低、高劑量組腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)指數(shù)顯著下調(diào),與模型組比較差異有顯著性意義(P005),結(jié)果見表3。表3各組對荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)的影響

同一組織切片中腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)情況與間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤程度進(jìn)行對比觀察,發(fā)現(xiàn)FasL表達(dá)陽性高的標(biāo)本,腫瘤間質(zhì)中浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量相對較少,存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3討論

Fas受體(死亡分子)和它的配體FasL(死亡因子),屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體和配體家族的跨膜糖蛋白,其之間的相互作用是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。FasL分布于活化的T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、單核巨噬細(xì)胞以及免疫豁免區(qū)組織細(xì)胞表面［7］。T細(xì)胞在T細(xì)胞抗原受體(TCR)的誘導(dǎo)下,一方面被活化,另一方面被誘導(dǎo)表達(dá)Fas和FasL。相鄰的活化T淋巴細(xì)胞的Fas和FasL相互作用可以彼此殺傷,活化T細(xì)胞表面Fas/FasL相互作用也可導(dǎo)致直接自殺。另外,FasL還可以從細(xì)胞膜表面脫落下來,形成可溶性配體分子,這些可溶性分子可以通過自分泌或旁分泌的方式,作用于自身細(xì)胞和鄰近活化T細(xì)胞,分別進(jìn)行自分泌殺傷和旁分泌殺傷。

許多腫瘤細(xì)胞如黑色素瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞均可表達(dá)大量的FasL［8］,有研究表明FasL表達(dá)陽性的直腸癌細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移后更容易生長,原因可能是FasL表達(dá)陽性的癌細(xì)胞可借此逃避免疫細(xì)胞的攻擊［9］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤模型組FasL陽性表達(dá)指數(shù)較高,與文獻(xiàn)［1，8］報(bào)道一致,而LBP高、低劑量組用藥后FasL表達(dá)水平下降,與模型組比較差異有顯著性意義。由于腫瘤細(xì)胞增殖密度大小代表腫瘤細(xì)胞的增殖活躍程度,而核分裂像計(jì)數(shù)是評估腫瘤細(xì)胞增殖水平的有效方法之一,也代表腫瘤細(xì)胞的增殖活躍程度［10］,因此,本實(shí)驗(yàn)對照比較了各組腫瘤細(xì)胞增生密度、核分裂計(jì)數(shù)等指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在LBP用藥后,隨著FasL表達(dá)下降,腫瘤細(xì)胞密度、核分裂計(jì)數(shù)有不同程度的減低。

腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的多少可以間接反映機(jī)體的免疫功能狀況及對腫瘤細(xì)胞生長的抑制能力,腫瘤FasL(+)區(qū)較FasL(-)區(qū)具有明顯的TIL凋亡,這可能是導(dǎo)致TIL數(shù)量減少,使腫瘤增殖局部產(chǎn)生免疫耐受的原因之一。有研究報(bào)道,肝癌FasL陽性患者TIL凋亡指數(shù)是FasL陰性患者的2倍［11］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察各組FasL表達(dá)情況與腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤情況,發(fā)現(xiàn)FasL表達(dá)與TIL數(shù)量之間有較密切的關(guān)系,在FasL表達(dá)較高的模型組,TIL數(shù)量較少,而LBP用藥后,隨著FasL表達(dá)的下降,TIL數(shù)量增加,表現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。本課題組通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了LBP對腫瘤微環(huán)境中TIL的影響,其相同的作用亦被初步證實(shí)［12］。

通過上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測LBP可能通過下調(diào)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá),進(jìn)而干預(yù)腫瘤細(xì)胞對免疫活性細(xì)胞的“反擊”,使免疫活性細(xì)胞的凋亡減少,從而改善了腫瘤微環(huán)境中的免疫功能狀態(tài),促成腫瘤細(xì)胞生長的抑制。由于LBP提高了機(jī)體的抗腫瘤免疫功能,在整體上則表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效應(yīng),其抗腫瘤確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

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