酵母單雜交實(shí)驗(yàn)步驟總結(jié)

1pBait-AbAi〔酵母報(bào)道子的構(gòu)建〕注：酵母報(bào)道子〔pBait-AbAi〕插入到pAbAiAbAirDNA20bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最便利牢靠的途徑。 設(shè)計(jì)并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與pAbAi〔建議合成一個(gè)目的序列的突變序列作為比照，以排解可能的假陽(yáng)性〕。TEbuffer100」mol/L。 1:1〔50「mol/L〕。95C30s,去除二級(jí)構(gòu)造。72C保溫2min，37C保溫2min，25C保溫2min。注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20C1JLpAbAi注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測(cè)是否酶切完全。1000.5」mol/L。(9)在連接反響管中參加如下成分：pAbAi載體(50ng/」L) 1.0JLannealedoligonucleotide(0.5

Jmol/L)

1.0JL10XT4DNAligasebufferBSA(10mg/mL)Nuclease-freeH2OT4DNAligase(400UM)總體積

1.5JL0.5JL10.5JL0.5JL15JL1JLnuclease-freeH2O照?！?0〕3h，Ecoli，承受常規(guī)方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆。供參考注：可用酶切或測(cè)序進(jìn)展檢測(cè)。LinearizepBait-AbAiandLinearizepBait-AbAiandintegrateintotheur&3-52locusofYlHGoldadE UMJ3Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意圖用BstBIBbsI2pBait-AbAi,pMutant-AbAi,p53-AbAi質(zhì)粒，URA3MatchmakerYeastTransformationSystem21

JlY1HGold稀釋每個(gè)轉(zhuǎn)化體系至1/10、1/100、1/1000,分別取每個(gè)稀釋物均勻涂于SD/-Ura3d5MatchmakerInsertCheckPCRMix1PCRY1HGold在PCR管中加25TPCR-gradeH2O。 PCR-gradeH2O注：切忌挑取整個(gè)酵母單克隆，由于細(xì)胞過(guò)多會(huì)阻擋 。假設(shè)參加細(xì)胞后水變渾濁，證明參加了過(guò)多的酵母細(xì)胞。向每個(gè)管中參加25JlMatchmakerInsertCheckPCRMix，混勻，離心。每PCRMatchmakerInsertCheckPCRMixH20/yeast總體積

25川PCR95C98C5568C

1min10s [30s卜30cycles2min>5PCR1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。AbAURA3Y1HGold1.4kb。4PCR4PCR檢測(cè)pBait-AbAi1.4kb1.35kb+insertsize PCRp53-AbAiSD/-Ura劃線培育。30C3d4CY1HGold［Bait/AbAi］菌株和［p53/AbAi］比照菌株。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期放置后，挑取單克隆在YPDA1mL(100mlYPDA50ml75%重懸菌體，速凍后與-70C3AbAr基因的表達(dá)在不存在捕獲物的狀況下，由于克隆到pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘餌菌株報(bào)告基因的本底表達(dá)水平也不一樣。例如： p53-AbAi比照的最低aureobasidinA抑制濃度為100ng/ml。注：酵母單雜交試驗(yàn)成功的前提是沒(méi)有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子能夠與目的序列結(jié)合或者結(jié)合力量格外弱。因此在進(jìn)展文庫(kù)篩選之前，檢測(cè)所構(gòu)建的誘餌菌株 AbAr基因的表達(dá)狀況格外重要。所以需要進(jìn)展試驗(yàn)以確定進(jìn)展文庫(kù)篩選時(shí)抑制誘餌菌株報(bào)告基因本底表達(dá)所需的AbA濃度。0.9%NaCIA6000.0022023/100」1)。100T，30C2-3doSD/-UraSD/-UrawithAbA(100ng/mL)SD/-UrawithAbA(150ng/mL)SD/-UrawithAbA(200ng/mL)預(yù)期結(jié)果如下所示：[AbA]/(ng/mL)0Y1HGold[p53-AbAi]克隆數(shù)約2023[AbA]/(ng/mL)0Y1HGold[p53-AbAi]克隆數(shù)約2023Y1HGold[pBait-AbAi]克隆數(shù)約20232000Baitdependent1000Baitdependent1500BaitdependentAbAAbA50-100ng/mL)，以徹底抑制誘餌菌株的生長(zhǎng)。200ng/mLAbAAbA500-1000ng/mLo然而，在不存在捕獲物的狀況下，假設(shè)1000ng/mLAbAAbAr基因的表達(dá)，那么很可能存在能夠識(shí)別并與目的序列結(jié)合的內(nèi)源調(diào)控因子，因而該目的序列無(wú)法用來(lái)進(jìn)展酵母單雜交篩選。cDNA提取試材總RNA，進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNApGADT7-ReccDNApolyA/或總RNA，humanplacentapolyA+RNA注：RNA，RNARNA在微量離心管中參加如下反響物：RNA模板〔0.025-1.0乜polyA和/或0.10-2.0乜總RNA〕1-2TCDSIII〔oligo-dT〕orCDS111/6〔random〕引物1.0DeionizedH2O〔使總體積到達(dá)4.0Jl〕1-2Jl總體積4.0JlcDNARNA1

Jl〔1

Jg〕controlpoly③72③72C2min。2min，輕輕混勻，馬上參加步驟⑤中的試劑。⑤每一個(gè)反響參加如下試劑，輕輕混勻離心。5Xfirst-strandbuffer2.0JlDTT〔100mmol/L〕1.0JldNTPmixture〔10mmol/L〕1.0JlSMARTM-MLVRT1.0總體積

5.0川好置于冰上。此步是cDNARNA/mix時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2min。CDSIII/6，25-30C10minCDSIII省略此步，進(jìn)展步驟⑦。42C10min。1SMARTIIIoligo，充分混合，42C1h。75C10min1TRNaseH〔2U〕。37C保溫20min。cDNA-20C3〔2〕longdistaneePCR〔LD-PCR〕合成cDNA其次鏈cDNARNALD-PCR的熱循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR2RNA1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26總RNA/JgPolyA+RNA/總RNA/JgPolyA+RNA/Jg循環(huán)數(shù)100First-strandcDNA(fromprotocolA)DeionizedH2O10xadvantage2PCRbuffer50xdNTPmix

2出70」l10川2川5”RACE3”RACEMeltingsolution50xadvantage2polymerasemix總體積

2210M241100PCR

95C30s95C10s-68C6min.1個(gè)循環(huán) 68C5min7PCR1.2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)使用1kbDNAladder。(2)使用CHROMASPIN+TE-400柱純化dscDNA⑴為每一個(gè)要純化的cDNACHROMASPIN+TE-400⑵將純化柱翻轉(zhuǎn)幾次，充分懸浮gelmatrix。⑶移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入2ml⑷將柱放入離心機(jī)，700g5mincDNAgelmatrix注：加到邊上易使樣品沿柱內(nèi)壁流下，易混有小片段 cDNA。⑹700g5mincDNAcDNA1/103mol/L(pH5.3)，混勻。2.5⑽-20C1h0室溫，14000r/min離心20min。留神棄去上清液，切勿遇到沉淀。14000r/min10mino注：一般枯燥至無(wú)乙醇味，不行過(guò)度枯燥，否則很難溶解。20JlcDNAcDNA1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。構(gòu)建并篩選酵母單雜交文庫(kù)(cDNA(1)SD/-Leu/AbAY1HGold[Bait/AbAi]菌株。注：AbASMARTtechnologydscDNA，2-5/20YeastTransformationSystem2質(zhì)：cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株20SMART-amplifieddscDNA〔2-5」g〕6川pGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔3Jg〕Y1HGold[53/AbAi]的轉(zhuǎn)化5Jlp53fragment〔125Jg〕2JlpGADT7-Rec，〔SmaI-linearized〕〔1Jg〕1/10、1/100、1/10001/10000100100mm平板。文庫(kù)轉(zhuǎn)化涂SD/-LeuSD/-Leu/AbA平板，比照p53SD/-LeuSD/-Leu/AbA200平板。將剩余的全部文庫(kù)轉(zhuǎn)化混合物〔約15ml〕150mmSD/-Leu/AbA150T。3-5do3-5dSD/-Leu100mm1篩選的克隆數(shù)=[cfu/mlonSD/-Leu]x[dilutionfactor]x[resuspensionvolume〔15ml〕]例如：resuspensionvolume=15mlPlatingvolume=100Jl250coloniesgrewonthe1/100dilutiononSD/-LeuplatesThenumberofclonesscreened=250cfu/0.1mx100x15ml=3.75million(7)預(yù)期結(jié)果陽(yáng)性比照試驗(yàn)：SD/-LeuSD/-Leu/AbA200培育基上的克隆數(shù)相近。文庫(kù)篩選試驗(yàn)：依據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計(jì)算所篩選的克隆數(shù)， 其結(jié)果應(yīng)大于1百萬(wàn)且SD/-Leu/AbA平板上的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于1百萬(wàn)陽(yáng)性克隆數(shù)目取決于誘餌序列。cDNA(1)陽(yáng)性克盛大劃線培育，進(jìn)展表型確認(rèn)SD/-Leu/AbA2-4d〔2〕PCR消退重復(fù)克隆MatchmakerInsertCheckPCRMix2pGADT7載體中的cDNA片段進(jìn)展擴(kuò)增MatchmakerInsertCheckPCRMixH20/Yeast總體積PCR

(Cat.No.630497)進(jìn)展PCR，對(duì)插入PCR管中參加以下反響物：25725円50T94C1min98C10s-68C3min一PCR1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)展電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常，這說(shuō)明在同一酵母細(xì)胞不存在一種捕獲載體注：為了確認(rèn)大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用 III或者其它常用的限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)展電泳分析。假設(shè)大量的克隆含有同一插入片段，則另取50PCR為了快速驗(yàn)證克隆，PCRT7〔3〕陽(yáng)性cDNA質(zhì)粒的分別獵?、俳湍钢形膸?kù)質(zhì)粒的分開(kāi)。隆里不只含有能激活A(yù)bAr白的cDNA那么很有可能獵取到非相互作用的質(zhì)粒。為了增加獵取陽(yáng)性克隆捕獲質(zhì)粒的幾率，可以將陽(yáng)性克隆在SD/-Leu/AbA培育基上重復(fù)涂布2-3次，每次都挑取單一的克隆進(jìn)展下一步涂布。②從酵母中獵取陽(yáng)性cDNA質(zhì)粒為了鑒定陽(yáng)性互作相關(guān)的基因，用EasyYeastPlasmidIsolationKit〔Cat.No.630467〕從酵母中獵取陽(yáng)性質(zhì)粒。③EcolicDNAcDNALB100g/mlampicillin進(jìn)展選擇?！?〕鑒別陽(yáng)性和假陽(yáng)性互作酵母單雜交篩選可能會(huì)檢測(cè)到假陽(yáng)性，用以下標(biāo)準(zhǔn)可以區(qū)分陽(yáng)性和假陽(yáng)性陽(yáng)性：AbAr列突變的狀況下，誘餌仍可以激活 AbAr報(bào)告基因。用下述程序在選擇培育基上對(duì)陽(yáng)性和假陽(yáng)性相互作用進(jìn)展確認(rèn)：①用YeastmakerTransformationSystem2的試劑和small-scale100ng獵取的捕獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)1HGold[Bait/AbAi]和Y1HGold[Mutant/AbAi]菌株中。注：陽(yáng)性比照和陰性比照試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)一起進(jìn)展。SD/-LeuSD/-Leu/AbA1001/101/100釋物。③30C3-5d3A樣品選擇