吸光光度法工優(yōu)秀課件

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第九章吸光光度法

9.1吸光光度法的基本原理

9.2光度計及其基本部件

9.3顯色反應及顯色條件的選擇

9.4吸光度測量條件的選擇

9.5吸光光度法的應用

29.1吸光光度法的基本原理

一、概述：

比色法：比較溶液顏色的深淺確定組分含量的一種方法。

吸光光度法是基于被測物質的分子對光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。3經(jīng)證明：不論溶液有無顏色，當一定波長的光通過該溶液時，總有一定程度的吸光作用。并且隨單位體積內溶液中該物質的質點數(shù)目增多，對光的吸收越強。

分光光度法：測量物質對一定波長光線的吸收程度確定組分含量的方法。

5化學分析與儀器分析方法比較化學分析：常量組分(>1%),Er0.1%～0.2%

依據(jù)化學反應,使用玻璃儀器

準確度高儀器分析：微量組分(<1%),Er1%～5%

依據(jù)物理或物理化學性質,需要特殊的儀器靈敏度高例:含F(xiàn)e約0.05%的樣品,稱0.2g,則m(Fe)≈0.1mg重量法

m(Fe2O3)≈0.14mg,稱不準容量法

V(K2Cr2O7)≈0.02mL,測不準光度法結果0.048%～0.052%,滿足要求6二、光的基本性質電磁波的波粒二象性

波動性光的傳播速度:

c－真空中光速2.99792458×108m/s

～3.0×108m/sλ－波長，單位：m,cm,mm,m,nm,?1m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10mν－頻率，單位：赫茲（周）Hz次/秒

n－折射率，真空中為1

7與物質作用電場向量磁場向量傳播方向YZ9波粒二象性結論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低。

單色光：具有相同能量(相同波長)的光。

混合光：具有不同能量(不同波長)的光復合在一起。10光學光譜區(qū)遠紫外近紫外可見近紅外中紅外

遠紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm~400nm400nm~780nm780nm~2.5m2.5m~50m50m~300m11三.

溶液中溶質分子對光的吸收與吸收光譜不同顏色的可見光波長及其互補光p238溶質分子對光的吸收：具有選擇性/nm顏色互補光400-450紫黃綠450-480藍黃480-490綠藍橙490-500藍綠紅500-560綠紅紫560-580黃綠紫580-610黃藍610-650橙綠藍650-780紅藍綠13Cr2O72-、MnO4-的吸收光譜300350400500525545MnO4-600700/nm350Cr2O72-1.00.80.60.40.2Absorbance14苯(254nm)甲苯(262nm)A230250270苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜1517２、T－透光率（透射比）（Transmittance）A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT=abc(9-1)18ATcA=kbcATcA=kbc吸光度A、透射比T與濃度c的關系19３、a

吸光系數(shù)

Absorptivity

當c的單位用g·L-1表示時，用a表示，

A＝abc（9-1）

a的單位:L·g-1·cm-1當c的單位用mol·L-1表示時，用表示。

ε－摩爾吸光系數(shù)MolarAbsorptivity

A＝εbc

（9-2）

的單位:L·mol-1·cm-1當c的單位用g·100mL-1表示時，用表示，

A＝bc，叫做比消光系數(shù)21

ε↗，方法的靈敏度↗。由實驗結果計算ε時，因以總濃度代替吸光物質的實際濃度，得出的是表觀摩爾吸收系數(shù)。

ε=Ｍa（9-3）

Lambert-Beer定律不僅適用溶液，也適用其他均勻非散射的吸光物質（氣體、固體）。

是各類吸光光度法定量分析的依據(jù)。22

４.吸光度的加和性A=A1+A2+…+An(9-4)

用參比溶液調T=100%（A=0），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑等對光的吸收等。23

吸光度與光程的關系A=εbc

光源檢測器0.00吸光度檢測器b樣品光源0.22吸光度光源檢測器0.44吸光度b樣品b樣品25朗伯-比爾定律的分析應用溶液濃度的測定A＝εbc工作曲線(標準曲線)01234mg/mLA。。。。*0.60.40.2026五、偏離朗伯－比耳（爾）的原因１、非單色光引起的偏離

朗伯－比耳定律只適用單色光

p241

儀器僅能提供波長范圍較窄的復合光01234mg·mL-1A。。。。*0.80.60.40.2029減免：配稀溶液，避免溶液產(chǎn)生膠體與混濁1單色光

(見p241證明)

應選用max處或肩峰處測定

2.吸光質點形式不變

離解、絡合、締合會破壞線性關系應控制條件(酸度、濃度、介質等)3.稀溶液

濃度增大，分子之間作用增強30

x104(nm)亞甲藍陽離子單體max=660nm二聚體max=610nm二聚體的生成破壞了A與c的線性關系亞甲藍陽離子水溶液的吸收光譜a.6.36×10-6mol·L-1b.1.27×10-4

mol·L-1c.5.97×10-4

mol·L-1319.2光度計及其基本部件P242

9.2.1分光光度計的類型32

光電二極管陣列(通常具有316個硅二極管)photodiodearrays(PDAs)

同時測量200～820nm范圍內的整個光譜,比單個檢測器快316倍,信噪比增加3161/2

倍.

多通道儀器（MultichannelInstruments）其他類型分光光度計將光度計放入樣品中,原位測量.對環(huán)境和過程監(jiān)測非常重要.纖維光度計33鍍鋁反射鏡纖維光度計示意圖34纖維光度計359.2.2光度分析的幾種方法1.目視比色法觀察方向c4c3c2c1c1c2c3c4方便、靈敏，準確度差。常用于限界分析。362.光電比色法通過濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)光電比色計結構示意圖靈敏度和準確度較差373.吸光光度法和分光光度計通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光.波長可調,故選擇性好,準確度高.光源單色器吸收池檢測系統(tǒng)穩(wěn)壓電源分光光度法的基本部件38濾光片：有色玻璃片，只允許和它顏色相同的光通過，得近似的單色光。

其質量以“半寬度”表示。

半寬度：峰高一半處的峰寬。最大透光度的一半處曲線的寬度。選擇原則：濾光片的顏色與溶液的顏色互補。

濾光片透過的光應是顏色溶液最易吸收的光。39722型分光光度計結構方框圖光源分光系統(tǒng)吸收池檢測系統(tǒng)40分光光度計的主要部件光源：發(fā)出所需波長范圍內的連續(xù)光譜，有足夠 的光強度,穩(wěn)定。 可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。棱鏡:玻璃350～3200nm,石英185～4000nm

半寬度5～10nm

光柵:波長范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便。半寬度～0.1nm41單色器棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同入射狹縫準直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ280060050040042光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。原理：利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光.M1M2出射狹縫光屏透鏡平面透射光柵光柵衍射示意圖43吸收池：(比色皿)用于盛待測及參比溶液。 可見光區(qū)：光學玻璃池 紫外區(qū)：石英池1、光潔，2、液2/3處3、手持毛玻璃處4、透光面垂直于光束方向檢測器：利用光電效應，將光能轉換成電流訊號。 光電池，光電管，光電倍增管指示器： 低檔儀器：刻度顯示（p)

中高檔儀器：數(shù)字顯示，自動掃描記錄44檢測器硒光電池Ag、Au45光電管紅敏管625-1000nm藍敏管200-625nm46光電倍增管160-700nm1個光電子可產(chǎn)生106～107個電子479.3顯色反應與分析條件的選擇9.3.1顯色劑與顯色反應無機顯色劑:SCN-

[Fe(SCN)]2+H2O2

[TiO·H2O2]2+有機顯色劑:O生色團：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe：：：：助色團－NH2，－OH，－X（孤對電子）ne48有機顯色劑OO型：OHCOOHSO3H磺基水楊酸NNNN型：鄰二氮菲CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝丁二酮肟ON型：NNNOH

OHPARNHNHNSNS型：雙硫腙49顯色反應的選擇*靈敏度高，一般ε>104*選擇性好顯色劑在測定波長處無明顯吸收。

對照性好,λmax>60nm.*反應生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定。*顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。501.顯色劑用量（c(M)、pH一定）9.3.2顯色條件的確定c(R)c(R)c(R)Fe(SCN)n3-nMo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅512.顯色反應酸度（c(M)、c(R)一定）pHpH1<pH<pH252鄰二氮菲－亞鐵反應完全度與pH的關系

β3FeR3H＋H＋A檸檬酸Fe2++3Rβ3＝1021.3c(R)≈[R′]=10-4mol·L-153pH3～8為適宜的酸度范圍543.顯色溫度及顯色時間T1(℃)T2(℃)At(min)另外，還有介質條件、有機溶劑、表面活性劑等559.3.3干擾及消除1.化學法測Co2＋(含F(xiàn)e3+):(掩蔽法)Co2＋,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－56測Co2＋

:(生成配合物性質不同)Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnRNiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

鈷試劑RH+測Fe3＋:(控制pH)Fe3+,Cu2+FeSS（紫紅）Cu2+pH2.5SS如不能通過控制酸度和掩蔽的辦法消除干擾，則需采取分離法。572.物理法—選擇適當?shù)臏y定波長515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡合物絡合物試劑試劑58可見光（380～780nm）紫外光（200～380nm)中紅外（2.5～50m)光源鎢燈碘鎢燈320～2500氫燈氘燈180～375硅碳棒（紅外線）吸收池材料玻璃（350～3200）石英（185～4000）NaCl晶體吸光光度法儀器主要差異比較599.4吸光度測量條件的選擇

9.4.1入射光的選擇

1、首先選擇在max下進行測量，靈敏度高。對朗伯-比耳定律的偏離小。若最大吸收波長不在儀器可測波長范圍內或處于干擾成分有強烈的吸收時

2、選擇次高峰對應波長為入射波長

☆應選擇ε值隨波長改變不太大的區(qū)域內的波長。

60

9.4.2參比溶液的選擇因吸光的加和性，除有溶質的吸光外，還包括顯色劑、溶劑，其他試劑對光的吸收

應將顯色劑、溶劑，其他試劑對光的吸收的吸收扣除----選擇參比溶液參比溶液的選擇原則：61

選擇適當?shù)膮⒈热芤?/p>

1.僅配合物有吸收，溶劑作參比。

如phen—Fe2+

標準曲線2.顯色劑或其他試劑略有吸收，空白溶液作參比

例:鄰二氮菲光度法測Li2CO3中的Fe，參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。

623.試樣液中其它成分有吸收，但不與顯色劑反應：

①顯色劑無吸收時：

試樣溶液作參比。

如測汽水中的Fe

②顯色劑略有吸收時：

于試液中加入掩蔽劑將被測成分掩蔽，再加入顯色劑，將該溶液作參比。639.4.3吸光度讀數(shù)范圍的選擇光度計的讀數(shù)誤差一般為0.2～2％(ΔT),由于T與濃度c不是線性關系，故不同濃度時的ΔT引起的誤差不同。100806040200T%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率讀數(shù)誤差

cc1c1c2c2c3c3><64

吸光光度法中，儀器測量不準也是誤差的主要來源。

A=-lgT=εbc⑴

透過率讀數(shù)誤差DT基本是個常數(shù)，因為T的標尺是均勻的，DT是由儀器刻度讀數(shù)不可靠引起的誤差，和T的大小無關

吸光度讀數(shù)誤差DA是隨著A的不同而變化，因為A的刻度標尺是不均勻的，DA隨著A的增大而增大65

不同的吸光度數(shù)值A下，吸光度讀數(shù)誤差帶來的測定濃度誤差dc/c是不同的66

假設△T為0.5%，繪制不同透過率下濃度相對誤差變化曲線如圖9-16（p254）：T過高或過低，dc/c都是很大的，T在適宜的范圍內測量誤差才是可以接受的利用（9-5）公式令其導數(shù)為零，求出：T=0.368（A=0.434）濃度誤差最小，約為±1.4%。671086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關系實際工作中，應控制T在70

～10％,

A在0.15～1.0之間

(調c,b,)68調整比色皿厚度和取樣量等達到★濃度誤差大小和T/A的讀數(shù)范圍有關：

T=70～10%/A=0.15～1.0時，濃度測量誤差為1.4-2.2%；如果要求準確度高些，可控制T=65-20%/A=0.2-0.769

吸光光度法的應用1.單一組分測定（標準曲線法）1)金屬離子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-鈷試劑2)