基因的染色體定位

基因的染色體定位關(guān)鍵詞：基因定位熒光原位雜交放射雜交體在人類基因組計(jì)劃（HGP）中有二大部分內(nèi)容，一是在2005年之前完成對(duì)人類基因組DNA約3X109個(gè)核苷酸序列的測(cè)定，同時(shí)完成對(duì)基因的染色體定位工作；二是開展基因功能的研究?；蚨ㄎ慌c基因序列兩者相輔相成，基因染色體的定位既有助于基因序列的測(cè)定，又有利于對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的研究，有利于進(jìn)一步提示生物的遺傳信息?；驕y(cè)序技術(shù)，尤其是大規(guī)模測(cè)序技術(shù)的建立，極大地提高了基因測(cè)序的速度。到1999年1月25日為止，全世界已測(cè)出全部人類基因序列的7.3%，而部分生物，如酵母、大腸桿菌等的序列已全部測(cè)定完畢，這樣cDNA的染色體定位工作就顯得尤為迫切。然而由于目前的基因大規(guī)模測(cè)序是建立在基因定位的基礎(chǔ)之上，而基因組的染色體定位（基因作圖）工作跟不上基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，因而成了限制基因序列測(cè)定的主要因素。基因的染色體定位方法多種多樣，它可分為基因的遺傳作圖和物理作圖，而物理作圖中最主要是熒光原位雜交（FISH）和放射雜交體（RH）二種。本文就目前主要的幾種基因作圖方法作一介紹。1熒光原位雜交（FISH）原位雜交（ISH）原早被用于染色體組型和核酸分布的分析，后來(lái)，隨著技術(shù)的發(fā)展，它被用于基因染色體定位的研究，特別是非同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使得ISH的應(yīng)用日前廣泛。目前它已被用于腫瘤的細(xì)胞遺傳改變、人類的早期發(fā)育、核與基因組的分子結(jié)構(gòu)、不同種屬間的基因圖譜比較、動(dòng)物的細(xì)胞發(fā)生和無(wú)數(shù)的基因定位研究。用于基因染色體定位的FISH已被稱為CO-FISH或COD-FISH（chromosomeorientationanddirectionFISH）［1］。CO-FISH技術(shù)是以生物素或地高辛等半抗原為標(biāo)記物，采用隨機(jī)引物法或缺口平移法標(biāo)記DNA探針，將探針變性后即可用于細(xì)胞分裂中期或間期細(xì)胞核染色體的原位雜交并產(chǎn)生DNA-DNA雜交體，這種雜交體可以被與半抗原有高度親和力的熒光標(biāo)記分子所檢測(cè)到，而這種雜交信號(hào)又可以被與熒光分子偶聯(lián)的單抗所放大。此外，DNA探針也可以直接標(biāo)以熒光分子，這些熒光分子有：FITC、德克薩斯紅（texasred）及最近開發(fā)的花青染料（cyaninedyes）等，如果這樣，就不需要進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和放大就可以直接觀察DNA-DNA雜交體［2］。用于FISH的DNA底物已經(jīng)由原先固定的染色體和間期細(xì)胞核發(fā)展到伸展的單鏈DNA分子、細(xì)胞核及染色體的自然形態(tài)等［3］。由于FISH技術(shù)已經(jīng)可以在伸展的DNA分子上進(jìn)行，這樣它的分辨率就達(dá)到1?2kb，并能在此區(qū)域內(nèi)作圖。而傳統(tǒng)的在細(xì)胞中期和間期進(jìn)行的FISH只能分別分辨1?5Mb和50kb左右的區(qū)域，分辨率的提高使得更詳細(xì)的基因結(jié)構(gòu)和基因內(nèi)重排研究成為可能；FISH對(duì)自然狀態(tài)下細(xì)胞和染色體的研究可以闡明核成分的分布并且不會(huì)出現(xiàn)象計(jì)算機(jī)三維重建分析時(shí)的干擾現(xiàn)象；同時(shí)，還能對(duì)二條同源染色體轉(zhuǎn)錄活性的核功能進(jìn)行研究，并可直接觀察基因表達(dá)過(guò)程中核成分的位置。FISH不僅能對(duì)固定的標(biāo)本進(jìn)行研究，還能對(duì)新鮮的標(biāo)本進(jìn)行研究，更有報(bào)道認(rèn)為它能分辨單一堿基的替換［4］。用于基因定位的FISH技術(shù)經(jīng)歷了從用洗滌劑或堿裂解液處理細(xì)胞核產(chǎn)生伸展?fàn)钊旧|(zhì)，從機(jī)械拉展染色質(zhì)到分子梳，再到最近的動(dòng)態(tài)分子梳技術(shù)（dynamicmoleularcombingDMC）［5］。DMC技術(shù)是分子梳技術(shù)和熒光雜交技術(shù)的結(jié)合，它分為四個(gè)步驟：①制備三氯硅烷包被的玻片；②從低熔點(diǎn)瓊脂糖膠中制備DNA溶液；③將玻片浸于溶液里5分鐘，使DNA結(jié)合到玻片上；④用300um/s的速度將玻片從溶液中抽出。由于在玻片-溶液界面處，浸在溶液中的部分對(duì)已抽出部分有一種持續(xù)的回復(fù)力，加上它們的疏水性，硅烷的表面很快就干燥，使得被拉長(zhǎng)的DNA纖維不可逆地被固定于玻片表面，這種DNA纖維呈平等狀、單方向分布，似梳子狀。整個(gè)表面的伸展是均一的（2kb/um），它不受DNA片段大小的影響。與其它方法相比，DMC技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：①在整個(gè)平面的伸展可使雜交信號(hào)為單一信號(hào)，無(wú)需標(biāo)化。②不同的表面和不同的溶液中DNA的伸展無(wú)變化。③高密度的基因組DNA和雜交信號(hào)可使統(tǒng)計(jì)分析在一張22X22mm的載玻片上即可進(jìn)行。④一定的DNA斷裂可產(chǎn)生持續(xù)的可分析數(shù)百kb的DNA片段。⑤可從同一種DNA溶液中制備出許多伸展平面。2放射雜交體法（RH）盡管FISH技術(shù)可以對(duì)基因進(jìn)行染色定位，但是從分子角度來(lái)看，它的定位工作仍顯得較粗糙，它只能將基因定位于百萬(wàn)個(gè)堿基的范圍（2%的染色體長(zhǎng)度）。因此發(fā)展一種較敏感的技術(shù)勢(shì)在必行。RH就是在這樣的情況下產(chǎn)生的，它的基礎(chǔ)是Goss和Harris早期的工作，他們用大劑量的X射線照射細(xì)胞，使染色體斷裂；但是通過(guò)細(xì)胞融合嚙齒動(dòng)物細(xì)胞DNA中并被其修復(fù)。在染色體上間隔越遠(yuǎn)的兩個(gè)標(biāo)記，越容易被X射線所打斷從而分離，出現(xiàn)在受體細(xì)胞的基因組DNA的不同位點(diǎn)。大約通過(guò)對(duì)100個(gè)這種染色體被修復(fù)的融合細(xì)胞克隆DNA的標(biāo)記間斷裂頻率和距離的分析，就可得出這些標(biāo)記在其自身染色體上的位置［6,7］。然而，RH法作圖是建立在統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)上，因此，由RH法確定的遺傳圖譜并不一定真正代表標(biāo)記物在染色體上的位置，所以建立一種特定順序相對(duì)性的測(cè)量方法顯得十分必要。Cox等人對(duì)作了研究。他們不用二倍體的細(xì)胞而采用只含單一染色體的單倍體細(xì)胞，得到了較好的效果。由于RH法作圖并不依賴于靶染色體上可供選擇的標(biāo)記物的有無(wú)，因此在理論上它可以對(duì)細(xì)胞中單一拷貝的染色體進(jìn)行分析；此外，RH另一個(gè)特點(diǎn)是它的圖譜精度可以由X線折照射劑量來(lái)控制，一般來(lái)說(shuō)，8000rad的劑量比較適中［8］。上述這種RH方法又稱為照射融合基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（irradiationandfusiongenetransfer，IFGT），這種方法比較繁鎖，每條染色體需要100?200個(gè)雜交體細(xì)胞，這樣人的整個(gè)基因組就需要4000個(gè)雜交細(xì)胞體。Walter等人就此作了改進(jìn)，他們不用嚙齒動(dòng)物細(xì)胞雜交體，而是采用二倍體的成纖維細(xì)胞，并將改進(jìn)后的方法稱之為全基因組照射融合基因轉(zhuǎn)移放射雜交體法（wholegenomeirradiationandfusiongenetransferradiationhybuids，WGRHs）［9］。他們只需44個(gè)細(xì)胞克隆即可以對(duì)對(duì)整條染色體進(jìn)行定們分析，而且這種方法可以對(duì)大量的樣本進(jìn)行分析，大大減少了工作量和提高了工作效率。目前已有商品化的小鼠全基因放射雜交體板可供使用，這種板由Goodfellow博士的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，他們是將照射后的小鼠129胚細(xì)胞與TK-A23倉(cāng)鼠細(xì)胞系融合［10］。3脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）小的DNA分子(V30?40kb)在瓊脂糖凝膠電泳中的泳動(dòng)速度與其大小的對(duì)數(shù)成反比，而大的DNA分子其泳動(dòng)速度卻與其大小無(wú)關(guān)，只與電泳材料的孔徑有關(guān)。由此Schwartz等提出改變電泳或電場(chǎng)的方法可達(dá)到分離大分子DNA的目的［11］。它需要提取大分子量的DNA，再用稀有切割酶將DNA切成50kb以上的高分子量DNA。由于稀有切割酶的識(shí)別位點(diǎn)多為6個(gè)堿基，而其中又往往含有CpG二核苷酸。因?yàn)镃pG=核苷酸多以甲基化的形式存在于脊椎動(dòng)物基因組中，易于脫氨和發(fā)生C-T轉(zhuǎn)化突變；這種情況多在脊椎動(dòng)物已知的看家基因5’出現(xiàn)，?40%的基因有組織特異性表達(dá)；這樣如果在基因組DNA中檢測(cè)到一個(gè)稀有切割酶識(shí)別位點(diǎn)，在很大程度上就可以認(rèn)為是一個(gè)CpG島和一個(gè)基因的5’端。此外，基因組DNA的甲基化是組織和發(fā)育階段特異性且經(jīng)常甲基化不完全，這樣用稀有切割酶切割就產(chǎn)生消化不全現(xiàn)象，不同的甲基化類型具有不同的消化產(chǎn)物，在PFGE電泳上就可區(qū)分出個(gè)體的不同組織、不同個(gè)體的同一組織、不同種類的個(gè)體和由體細(xì)胞雜交制備的DNA等［12］。PFGE可以產(chǎn)生涵蓋50kb到5Mb的基因組圖譜，但它比較繁鎖和工作量較大。稀有酶的缺乏和稀有切割分布的隨機(jī)性使得PFGEF方法難以排列數(shù)百kb以上的序列。4Contig拼接(contigassembly)和染色體步移(chromosomewalking)正如象多態(tài)微衛(wèi)星的出現(xiàn)使基因作圖產(chǎn)生革命性變化一樣，YACs之類大基因片段(>100kb)的成功分離，使得眾多哺乳動(dòng)物基因組物理標(biāo)簽和長(zhǎng)距離圖譜的構(gòu)建成為可能。目前構(gòu)建YAC文庫(kù)的載體多為標(biāo)準(zhǔn)的pYAC4載體，它含有著絲粒和端粒以保證染色體在酵母細(xì)胞中呈穩(wěn)定的線性分子。極高分子量的基因組DNA就插入在選擇載體的臂之間，連接的人工染色體導(dǎo)入酵母的原生質(zhì)體中復(fù)制并保持穩(wěn)定。YACs中插入片段的長(zhǎng)度在500kb?1Mb之間，它足以被用于物理作圖。目前用于YAC文庫(kù)篩選的方法基于二種基本技術(shù)：①是PCR技術(shù)［13］，②是雜交技術(shù)［14］。盡管雜交技術(shù)有其特點(diǎn)，但其信號(hào)低、重復(fù)元件產(chǎn)生的高背景及技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，使得它已漸漸被PCR方法所淘汰。尤其是IRS-PCR(interspersedrepetitivesequencePCR)的出現(xiàn)，更使PCR在其中的優(yōu)勢(shì)得到充分體現(xiàn)［15］。一旦YAC的末端被分離，接下來(lái)的關(guān)鍵是確定二個(gè)末端是否與預(yù)期的標(biāo)簽相匹配，由于被分離的YAC末端極少適合于FISH，故只能用Southern雜交；如果這個(gè)末端測(cè)序后可作為STS(sequencetagsite)的話，也可以用PCR的方法進(jìn)行鑒定。而最簡(jiǎn)單的方法是通過(guò)contig標(biāo)簽與已知YAC比較來(lái)確定新YAC的位置；如果這個(gè)不行的話，可將末端與體細(xì)胞雜交體或放射雜交體板、基因組PFGE圖譜等一起分析［16］。由于YAC克隆存在的一些缺點(diǎn)，如嵌合和重組等，現(xiàn)在又發(fā)展了細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)、噬菌體P1克隆系統(tǒng)和P1衍生的人工染色體(P1-derivedartificialchromosome，PACs)等，這些質(zhì)粒均是在細(xì)菌中進(jìn)行繁殖，易于轉(zhuǎn)導(dǎo)，可對(duì)插入末端進(jìn)行直接測(cè)序，有關(guān)這些系統(tǒng)的詳細(xì)情況可從.中獲得。目前BACs和PACs已成為基因組計(jì)劃的"序列準(zhǔn)備"模板(sequence-readytemplate)。利用文庫(kù)構(gòu)建整條染色體或基因組的物理圖譜主要采用二種方法：一是使用含有STS的圖譜，根據(jù)有序的、重疊的STS構(gòu)建，它的首要前提是高密度、具有良好順序的STS圖譜；二是通過(guò)建立大的標(biāo)簽進(jìn)行指紋分析。利用PCR和雜交，再結(jié)合限制酶消化，即可進(jìn)行染色體步移。5基因定位克隆(positionalcloning)基因定位克隆即是一種基因克隆的方法，同時(shí)又是一種基因定位方法。一些與遺傳病相關(guān)基因的克隆多采用這種方法，它先根據(jù)已知的遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析和系譜分析，先確定候選基因所在的位置，再通過(guò)其它方法獲得基因的全部序列?；虻倪z傳連鎖分析原理可參閱文獻(xiàn)[17]。大規(guī)模遺傳連鎖分析所需的計(jì)算機(jī)軟件可以從下列網(wǎng)址中獲得：/genome-software;突變表型資源庫(kù)在：和o基因定位克隆中獲得基因序列的方法大致有[18]:①對(duì)關(guān)鍵部位進(jìn)行直接測(cè)序，目前已經(jīng)可以對(duì)500kb左右的區(qū)域進(jìn)行直接測(cè)序；②比較基因組作圖和測(cè)序，具體原理在下面講述，有關(guān)的信息可從/XREFdb/中得到；③位置候選分析(positionalcandidateanalysis)，從某種程度上講，它將成為基因定位克隆的標(biāo)準(zhǔn)步驟，它是在被克隆的基因(往往是ESTs形式)和它們相應(yīng)的染色體位置日前收錄在:http://www-shgc//cgi-bin/smsg#GOTO;④基因結(jié)構(gòu)特征分析，這方面主要有三種方法：HTF島作圖(非甲基化CpG二核苷酸)、進(jìn)化保守區(qū)分析和外顯子捕獲。HTF作圖法根據(jù)的是稀有切割酶對(duì)基因組DNA的特征性切割，產(chǎn)生可識(shí)別的標(biāo)記，如基因的5’端和CpG二核苷酸等，有人又稱這為限制性標(biāo)記基因組掃描(restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS)[19];⑤cDNA捕獲，它是根據(jù)基因組DNA和已知cDNA序列同源，它們就能形成異二聚體。這樣將二者接上接頭雜交后，再經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增等即可得到未知基因。6比較基因作圖(comparativegenemapping)或比較物理圖譜(comparativephysicalmaps)基因非編碼區(qū)的進(jìn)化明顯比編碼區(qū)快得多，通過(guò)對(duì)不同種已知基因的比較可以發(fā)現(xiàn)，不同種屬的基因編碼區(qū)有相當(dāng)高的同源，性，因此可以利用這個(gè)特性進(jìn)行基因作圖和基因定位。也就是說(shuō)，一旦某一性狀被定位于動(dòng)物染色體的一特定區(qū)域，這些信息(附近的ESTs和候選基因等)也可以移植到人的相應(yīng)區(qū)域；同時(shí)，對(duì)一些不能在人體進(jìn)行的致死性狀的研究可以在動(dòng)物染色體上定位后，再映射到人類染色體的相應(yīng)位點(diǎn)。在這方面比較新的方法是L-yons等人的比較錨定標(biāo)簽序列_(comparativeanchor-taggedsequence，CATS)[20]和Marklund等人的異種二聚體分析(xenoduplexanalysis)[21]。CATS擴(kuò)增不同脊椎動(dòng)物的相同編碼序列，比較適合于對(duì)單一外顯子的擴(kuò)增，由于進(jìn)行連鎖分析的遺傳多態(tài)性在較短的編碼區(qū)內(nèi)比較難發(fā)現(xiàn)，且CATS擴(kuò)增出來(lái)的序列長(zhǎng)度一致，限制了體細(xì)胞雜交體圖譜的構(gòu)建，要克服這些困難又要花費(fèi)大量的人力物力。異種二聚體分析是在CATS基礎(chǔ)上改進(jìn)變而成，它是將不同物種的PCR產(chǎn)物混在一起進(jìn)行變性、復(fù)性，這樣同源的二條鏈就可雜交在一起，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出異種雜交體進(jìn)行分析，采用體細(xì)胞雜交體(SCH)作圖法作圖。7其它關(guān)于基因的染色體定位尚有不少其它的方法，不過(guò)這些方法幾乎均與上述介紹的方法相關(guān)，或者是與以下的一些方法結(jié)合，如：顯微分割法(microdissection)、熒光活化細(xì)胞分選方法(fluorescenceactivatedcellsorting,FACS)、變性寡核苷酸引物PCR(degenerateoligonucleotideprimerPCR，DOP-PCR)、體細(xì)胞雜交體(interspersedrepetitivesequencePCR，IRS-PCR)等[16，22]。參考文獻(xiàn)MeyneJetal.MethodsinMolecularBiology，Vol33:InSituHybridizationprotocols.ChooKHAed.HumanaPressInc.Totowa，NJ，1994.EkongRetal.CurrOpionBiotechnol，1998，9:19-24.BassHWetal.JCellBiol，1997，137:5-18.NilssonMetal.NatGenet，1997，16:252-255.