第六章酶工程

酶和細(xì)胞的固定化定義酶的固定化細(xì)胞的固定化應(yīng)用固定化酶

是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)的酶，能連續(xù)的進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。固定化酶的特點(diǎn)可以多次使用，穩(wěn)定性提高易于提純，產(chǎn)品質(zhì)量高易于控制，實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化控制酶利用率高比水溶性酶更適于多酶反應(yīng)酶的固定化載體結(jié)合法

將酶固定到非水溶性載體上的方法。根據(jù)固定方式的不同，這種方法又可以分為物理吸附法、離子結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法。交聯(lián)法

通過(guò)雙功能試劑，將酶和酶聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的方法。交聯(lián)法使用的交聯(lián)劑是戊二醛等水溶性化合物。

包埋法

將酶包裹在多孔的載體中

一、吸附法

物理吸附法靜止法電沉積法反應(yīng)器上直接吸附法混合浴或振蕩浴吸附法優(yōu)點(diǎn)： 固定化時(shí)酶分子的構(gòu)象很少 或基本不發(fā)生變化。缺點(diǎn)： 結(jié)合力弱，易解吸附。載體： 纖維素、瓊脂糖、活性炭、 沸石及硅膠等。離子結(jié)合法含有離子交換基團(tuán)的固相載體第一個(gè)離子結(jié)合法固定化酶：

DEAE—Cellulose

固定化過(guò)氧化氫酶第一個(gè)工業(yè)化的固定化酶：

DEAE-SephadexA-50

固定化氨基?；付?、包埋法凝膠包埋法首先被采用的凝膠包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙稀酰胺,丙稀酰胺引發(fā)劑－－inactiation包埋法—微膠囊法常用材料：聚酰胺膜火棉膠硝化纖維聚苯乙烯殼聚糖等微膠囊固定化酶制備方法界面聚合法

將酶水溶液和親水單體用一種與水不溶的有機(jī)溶劑制成乳化液，再將溶于同一種有機(jī)溶劑的疏水單體溶液邊攪拌邊加入到上述乳化液中，在乳化液中的水相和有機(jī)相之間的界面發(fā)生聚合作用，酶即被包埋于聚合體膜中。液體干燥法

將一種聚合物溶于一種沸點(diǎn)低于水且與水不溶的有機(jī)溶劑中，加入酶的水溶液，以油溶性表面活化劑，制成第一乳液。把它分散于含有保護(hù)性膠質(zhì)、聚丙烯醇和表面活性劑，形成第二乳液。在不斷攪拌、低溫和真空條件下蒸出有機(jī)溶劑，得到含酶微膠囊。其他方法脂質(zhì)體包埋法、纖維包埋法等三、共價(jià)交聯(lián)法雙功能試劑：常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶（四）共價(jià)偶聯(lián)法細(xì)胞的固定化優(yōu)越性

保持了胞內(nèi)酶系的原有狀態(tài)和天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。局限性（1）利用的僅是胞內(nèi)酶，且副產(chǎn)物多（2）細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體存在擴(kuò)散限制作用（3）載體孔隙的大小影響高分子底物的通透性酶的人工模擬一、模擬酶的概念和理論基礎(chǔ)二、模擬酶的分類和制備三、印跡酶一．模擬酶的概念和理論基礎(chǔ)概念根據(jù)酶的作用原理，用各種方法認(rèn)為制造的具有酶性質(zhì)的催化劑，簡(jiǎn)稱人工酶活模擬酶模擬酶的理論基礎(chǔ)模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)：主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)1.模擬酶的模擬酶的酶學(xué)基礎(chǔ)

過(guò)渡態(tài)理論對(duì)簡(jiǎn)化的人工體系中識(shí)別、結(jié)合和催化的研究2.主-客體化學(xué)和超分子化學(xué)主-客體化學(xué)：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補(bǔ)超分子：該分子形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價(jià)鍵相互作用，當(dāng)接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合形成穩(wěn)定的，具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實(shí)體，形成超分子功能：分子識(shí)別、催化、選擇性輸出二．設(shè)計(jì)要點(diǎn)設(shè)計(jì)前：酶活性中心-底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)酶的專一性及其同底物結(jié)合方式反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)及各中間物的知識(shí)設(shè)計(jì)中：為底物提供良好的微環(huán)境催化基團(tuán)必須相對(duì)于結(jié)合點(diǎn)盡可能同底物的功能團(tuán)相接近應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近生理?xiàng)l件下保持其催化活性三、模擬酶的分類分類依據(jù)

Kirby分類法按照模擬酶的屬性Kirby分類法單純酶模型機(jī)理酶模型單純合成的酶樣化合物1.Kirby分類法單純酶模型：

化學(xué)方法通過(guò)天然酶活性的模擬來(lái)重建和改造酶活性機(jī)理酶模型：

通過(guò)對(duì)酶作用機(jī)制諸如識(shí)別、結(jié)合和過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化的認(rèn)識(shí)，來(lái)指導(dǎo)酶模型的設(shè)計(jì)和合成單純合成的酶樣化合物

化學(xué)合成的具有酶樣催化活性的簡(jiǎn)單分子2.按照模擬酶的屬性主-客體酶模型膠束酶模型肽酶抗體酶分子印跡酶模型半合成酶2．環(huán)糊精結(jié)構(gòu)示意膠束酶模型第三節(jié)印跡酶一分子印跡技術(shù)概述二分子印跡酶分子印跡酶1．分子印跡概念：制備對(duì)某一化合物具有選擇性的聚合物的過(guò)程2.分子印跡技術(shù)內(nèi)容選定印跡分子和功能單體，使二者發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)在印跡分子-單體復(fù)合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)用抽提法從聚合物中除掉印跡分子3．分子印跡酶通過(guò)分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對(duì)底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，并可以在結(jié)合部位的空腔內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生催化基團(tuán)，并與底物定向排列。性質(zhì)：遵循米氏方程，催化活力依賴反應(yīng)速度常數(shù)。生物印跡生物印跡：指以天然的生物材料，如蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)為骨架，在其上進(jìn)行分子印跡而產(chǎn)生對(duì)印跡分子具有特異性識(shí)別空腔的過(guò)程。非水相生物印跡酶制備示意圖抗體酶一、抗體酶的概念二、抗體酶的催化特征三、抗體酶的催化作用機(jī)理四、抗體酶的催化反應(yīng)類型五、抗體酶的制備方法六、抗體酶的應(yīng)用抗體酶的概念抗體酶或催化抗體（Catalyticantibody)是一種新型人工酶制劑，是一種具有催化功能的抗體分子，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。它是利用現(xiàn)代生物學(xué)與化學(xué)的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。二、抗體酶的催化特征1.與天然酶相比抗體酶的特點(diǎn)能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性催化作用機(jī)制不同2.抗體酶和非催化性抗體作用的比較更高的反應(yīng)特異性反應(yīng)的可逆性反應(yīng)的量效性反應(yīng)過(guò)程三、抗體酶的催化作用機(jī)理1、過(guò)渡態(tài)理論與抗體酶2、抗體酶催化的三種重要反應(yīng)機(jī)制水解作用機(jī)制基團(tuán)轉(zhuǎn)移連續(xù)反應(yīng)機(jī)制3、抗體酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng)酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：抗體酶在有機(jī)溶劑中具穩(wěn)定性。脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：有機(jī)溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng)：在疏水溶劑中，活性較高。三、抗體酶的催化反應(yīng)類型1.轉(zhuǎn)?；磻?yīng)2.水解反應(yīng)3.Claisen重排反應(yīng)4.酰胺合成反應(yīng)5.Diels-Alder反應(yīng)6.轉(zhuǎn)酯反應(yīng)7.光誘導(dǎo)反應(yīng)8.氧化還原反應(yīng)9.脫羧反應(yīng)10.順?lè)串悩?gòu)化反應(yīng)四、抗體酶的制備1.細(xì)胞融合法：用設(shè)計(jì)好的半抗原，通過(guò)間隔鏈與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯(lián)制成抗原。然后對(duì)此抗原進(jìn)行免疫，使宿主有機(jī)體針對(duì)抗原產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生抗體的脾臟細(xì)胞與骨髓細(xì)胞相融合。融合得到的雜交細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能在體外培養(yǎng)。將雜交體克隆化，即能產(chǎn)生單一均勻的抗體。2.抗體結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)修飾法：抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾法加以改造。對(duì)抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基因。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親核性，易于氧化，及能通過(guò)二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點(diǎn)。3.引入輔助因子法

很多天然酶活性中心都含有金屬離子。Lerner等將金屬離子引入抗體酶，成功地催化了肽鍵的選擇性水解。他們用三乙撐胺Co3+鹽作為金屬離子輔因子，所用半抗原分子帶有一肽鍵。且通過(guò)羧根及仲胺基與金屬離子相連。將此半抗原通過(guò)共價(jià)鍵連接在載體蛋白免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵.4.抗體庫(kù)法用基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái)，重組到原核表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌直接表達(dá)有功能的抗體片段，從中篩選特異性的可變區(qū)基因抗原和抗體

當(dāng)外源物性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、毒素、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多糖、顆粒（細(xì)菌、細(xì)胞、病毒）進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)便產(chǎn)生相應(yīng)的免疫球蛋白（immuneglobin），并以之結(jié)合，以消除異物的毒害。此反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，此異物便是抗原，此球蛋白便是抗體。5.拷貝法：用酶作為抗原免疫動(dòng)物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動(dòng)物并進(jìn)行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對(duì)抗抗體進(jìn)行篩選，獲得具有原來(lái)酶活性的抗體酶。6.共價(jià)抗原免疫法這是在親和標(biāo)記抑制劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新的抗體酶制備方法。以親和標(biāo)記劑為半抗原，則抗體結(jié)合部位將產(chǎn)生與親和基團(tuán)電荷性質(zhì)相反的基團(tuán)，如親核性，親電性氨基酸，酸性氨基酸，堿性氨基酸等。五、抗體酶的篩選1.ELISA法；用ELISA法篩選對(duì)半抗原有親和力的單克隆抗體。2.酶學(xué)活性檢測(cè)法：直接用反應(yīng)底物檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的酶活性。3.短過(guò)渡態(tài)類似物法：以過(guò)渡態(tài)類似物中含有的必需基團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)單元做為篩選單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)。4.基因篩選法：應(yīng)用基因探針，對(duì)基因抗體庫(kù)進(jìn)行分析和篩選。六、抗體酶的應(yīng)用前景在有機(jī)相合成用于闡明化學(xué)反應(yīng)機(jī)制在醫(yī)療上的應(yīng)用在醫(yī)療上的應(yīng)用抗體酶在幫助戒毒方面的應(yīng)用

Landry等用可卡因水解的過(guò)渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產(chǎn)生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，其催化活性和血液中催化可卡因的丁酰膽堿酯酶差不多，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。因此，用人工抗體酶的被動(dòng)免疫也許能阻斷可卡因上癮，達(dá)到戒毒目的。2.抗體酶用于腫瘤治療

目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導(dǎo)前藥治療（ADEPT）技術(shù)，即將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會(huì)通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶就會(huì)將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物，從而提高腫瘤細(xì)胞局部藥物濃度，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力，達(dá)到提高腫瘤化療效果的目的。當(dāng)然交藥只能被抗體酶水解而不能被內(nèi)源性酶水解，抗原還要盡量減少免疫原性。2.抗體酶用于腫瘤治療

目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導(dǎo)前藥治療（ADEPT）技術(shù)，即將能水解前藥釋放出腫瘤細(xì)胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會(huì)通過(guò)和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細(xì)胞的表面。靜脈給藥后，當(dāng)藥物擴(kuò)散至腫瘤細(xì)胞的表面或附近，抗體酶就會(huì)將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物