第十四章 基因工程及其在醫(yī)學中的應用

同學們上午好主講葉輝單位溫州醫(yī)學院生化教研室上節(jié)課的重點內容1.掌握真核基因表達調控的特點；2.掌握順式作用元件、反式作用因子的概念及組成和轉錄因子的分類.復習與鞏固

是指利用重組DNA技術將目的基因和載體重組，再導入受體細胞內進行擴增和表達的過程。一.基因工程(geneticengineering)第一節(jié)基因工程基因工程相當于目的基因的無性繁殖過程，也稱其為基因克隆(geneclone)或分子克隆（molecularclone）。

第14章基因工程及其在醫(yī)學中的應用重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNAT4DNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移、制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等逆轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化（連），或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除5‘末端磷酸基，防止載體自身連接。二、基因工程操作中常用的工具

（一）工具酶

限制性內切酶(restrictionendonuclease)

定義:是一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基序列的核酸水解酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ

Ⅱ型限制酶識別序列特點—回文結構

GGATCCCCTAGG

一般識別雙鏈DNA的4～8個核苷酸順序，其中以6個核苷酸順序最為常見。EcoRⅠGTTCAAGCTTAAAATTCG+GAATTCCTTAAGHpaⅡGTTAACCAATTGAACTTG+平端切口粘端切口（5’和3‘突出端）切口：黏性切口和平端切口（二）載體1.定義：是攜帶目的DNA片段進入受體細胞進行擴增和表達的工具。2.分類：(1)克隆載體(cloningvector):使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。(2)表達載體(expressionvector):使插入的外源DNA序列轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。質粒

(plasmid)特點存在于細菌等細胞質中雙鏈環(huán)狀DNA分子大約1-200Kb具有自主復制和轉錄能力不能獨立存活

在子細胞中保持恒定的拷貝數(shù)并表達其遺傳信息常用載體：細菌質粒噬菌體黏粒病毒特點：多克隆位點篩選標記三、基因工程的操作過程基本過程目的基因的獲取重組DNA分子導入受體細菌目的基因與載體的連接克隆(或表達)載體的選擇和構建重組體的篩選與鑒定克隆基因的表達

和表達產物純化以質粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基因的獲得1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄基因組DNA文庫cDNA文庫粘性末端連接

（二）目的基因與載體的連接BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端導入種類載體宿主轉化質粒細菌轉染噬菌體或病毒真核細胞轉導噬菌體細菌轉化、轉染和轉導的區(qū)別（三）重組體導入受體細胞BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連（四）基因工程菌的篩選直接選擇法：

抗藥性標記選擇藍白斑篩選法

菌落或噬菌體的原位雜交非直接選擇法：免疫學方法(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄重組DNA技術操作過程可形象歸納為

小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交（五）外源基因的表達種類功能所含特異序列克隆載體外源基因擴增復制子多克隆位點篩選標志表達載體外源基因表達復制子多克隆位點篩選標志基因表達的調控序列克隆載體和表達載體的比較

分子雜交以DNA的變性和復性為理論基礎。DNA變性：DNA在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程。DNA的復性：變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程。分子雜交：不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。分子雜交

第二節(jié)常見分子生物學技術

一、分子雜交（molecularhybridization）

復性RNADNA（一）核酸探針（probe）

1、定義：

是分子雜交的技術基礎，它是一段與被檢測核酸序列互補的帶有標記的核苷酸片段，長度一般為十幾到幾千個堿基不等。

2、探針標記方法：（1）放射性同位素標記（2）光敏生物素標記（3）地高辛標志物（4）分子信標（二）分子雜交的方法斑點雜交(dotblothybridization)

DNA點陣（DNAarray）

基因芯片

（genechips）

原位雜交(insituhybridization)

轉移印跡技術變性DNA或RNA探針雜交液NC硅片（三）印跡技術的類別及應用1、DNA印跡技術

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。3、蛋白質的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質定性定量及相互作用研究。

分子雜交實驗①②③

二、聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C95?C55?C72?CPCR的主要用途（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）測定基因的表達水平三、DNA的序列分析放射自顯影凝膠電泳堿性專一性裂解反應A/GGC/TC5’GTCGTAA5’GTCGTA5’GTCGT5’GTCG5’GTC5’GT5’G--+硫酸二甲酯——G甲酸——A/G肼——C/T肼（NaCl）——C（一）化學裂解法(Maxam-Gillbert法)（二）DNA鏈末端合成終止法四、轉基因動物、克隆動物和基因剔除技術

（一）轉基因動物定義

是利用基因工程和胚胎工程技術，改變動物遺傳性狀的新方法，是將外源基因導入動物受精卵，再將受精卵植入到代孕動物的輸卵管或子宮中培育的動物。目錄（二）克隆動物

核轉移技術

將動物體細胞核全部導入另一個體的去胞核的受精卵內，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。多利誕生過程

（三）基因剔除技術也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內某種基因的技術。又稱基因敲除（geneknockout）?；蚯萌耄╣eneknockin）定義：是指利用分子生物學和分子遺傳學的技術方法通過直接檢測基因結構是否改變、基因表達有否異常，對疾病作出診斷?；蛟\斷的概念和特點特點：

針對性強；靈敏度高；適用范圍廣；早期診斷第三節(jié)基因工程在醫(yī)學中的應用

（一）基因診斷（genediagnosis）

甲型血友病基因組的限制性酶切分析×BclⅠ酶切位點5′5′3′突變基因99bp142bp43bp正?；?/p>

基因治療的概念早期將通過基因轉移技術用正?；蛟恢脫Q有缺陷的基因治療單