外源基因的原核表達(dá)系統(tǒng)

外源基因的原核表達(dá)系統(tǒng)第一頁，共三十五頁，2022年，8月28日提高外源基因表達(dá)水平的措施提高外源基因的表達(dá)效率，一般要考慮以下幾個(gè)原則1.優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，對(duì)決定轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子序列和決定mRNA翻譯的SD序列進(jìn)行優(yōu)化，要求SD序列與翻譯起始位點(diǎn)AUG的距離要合適，這樣才能獲得目的蛋白的高水平表達(dá)。2.避免使用稀有密碼子密碼子具有簡(jiǎn)并性，大腸桿菌基因?qū)δ承┟艽a子的使用表現(xiàn)出較大的偏愛性，同義密碼子使用的頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的tRNA的豐度正相關(guān)，稀有密碼子的豐度極低。在mRNA的翻譯過程中，往往會(huì)由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子的tRNA供不應(yīng)求，最終造成翻譯終止或移碼突變。第二頁，共三十五頁，2022年，8月28日3.提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性多數(shù)情況下，細(xì)菌的mRNA的半衰期很短，而外源基因mRNA的半衰期更短，若能增加外源mRNA的穩(wěn)定性，就有可能提高外源基因的表達(dá)水平。4.提高表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解原核細(xì)胞中外源蛋白往往不夠穩(wěn)定，易被蛋白酶降解從而使蛋白質(zhì)產(chǎn)量降低。采取措施提高目的蛋白的穩(wěn)定性，減少目標(biāo)蛋白的降解從而提高目的基因的表達(dá)水平。第三頁，共三十五頁，2022年，8月28日5.減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)，必然影響宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，而宿主細(xì)胞的代謝失常又會(huì)影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)。采取誘導(dǎo)表達(dá)和講宿主菌生長(zhǎng)和表達(dá)質(zhì)粒的復(fù)制分開等方式，平衡宿主細(xì)胞生長(zhǎng)于目標(biāo)蛋白表達(dá)這二者之間的矛盾。6.優(yōu)化發(fā)酵條件在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，工程菌株在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)條件的優(yōu)化控制對(duì)外源基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。優(yōu)化發(fā)酵過程既包括工藝方面的因素，也包括生物方面的因素。第四頁，共三十五頁，2022年，8月28日利用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)真核蛋白質(zhì)的實(shí)例干擾素基因工程

干擾素是一類多功能蛋白質(zhì)，具有抗病毒、抗腫瘤、抗細(xì)胞分裂以及調(diào)節(jié)免疫功能的作用，因而通過基因工程生產(chǎn)干擾素具有重要的意義。

人的干擾素有3類：（α）白細(xì)胞干擾素、（β）成纖維素干擾素、（γ）免疫干擾素。目前，白細(xì)胞干擾素和成纖維素干擾素基因的結(jié)構(gòu)基本了解：5’端有一段非翻譯序列，緊接著一段先導(dǎo)序列，其后是干擾素基因，編碼166個(gè)氨基酸，再后是3’非翻譯區(qū)，末端是多聚A。第五頁，共三十五頁，2022年，8月28日IFN-cDNA的制備分級(jí)分離把不同部分的mRNA分別注射到爪蟾卵母細(xì)胞中從誘發(fā)產(chǎn)生干擾素的白細(xì)胞中提取mRNA檢測(cè)干擾素抗病毒活性活性最高的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第六頁，共三十五頁，2022年，8月28日IFN-cDNA的修飾在cDNA兩端連接EcoRI識(shí)別序列，并在5’端連上信號(hào)序列。IFN-cDNA克隆修飾的cDNA與表達(dá)載體pBR322或YEpIpT連接，形成重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)分泌干擾素。我國科技工作者研制干擾素領(lǐng)域已獲得成功，通過基因工程生產(chǎn)的人αI型干擾素已于1990年正式投放市場(chǎng)。第七頁，共三十五頁，2022年，8月28日生長(zhǎng)激素基因工程

人生長(zhǎng)激素來自垂體，作為藥物可以用于治療兒童的侏儒癥、燒傷、傷口愈合，以及預(yù)防老年患者肌肉萎縮等。前體生長(zhǎng)激素的N端有一段23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，去掉信號(hào)肽之后就可以成為成熟的生長(zhǎng)激素。

在體外人工合成了起始密碼ATG與編碼前1-23個(gè)氨基酸的DNA片段并用反轉(zhuǎn)錄酶法合成了編碼24-191個(gè)氨基酸的DNA序列，將兩者連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌成功表達(dá)。第八頁，共三十五頁，2022年，8月28日hGH編碼的前24個(gè)氨基酸的DNA片段克隆先人工合成6個(gè)小片段U1-U6，再依次將6個(gè)片段連接為一個(gè)較大的片段，該片段兩端分別為EcoRI和HindIII黏性末端。利用酶切位點(diǎn)與pBR322相連，形成重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。hGH編碼24-191個(gè)氨基酸的DAN片段克隆利用反轉(zhuǎn)錄酶法，從人垂體提取mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再合成第二鏈，用HaeIII切割，利用瓊脂糖凝膠電泳分離純化551bp的DNA片段，經(jīng)末端轉(zhuǎn)移酶的作用在3’端加入多聚C尾，再在pBR322上加入多聚G尾，使二者重組，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增。hGH基因的克隆將兩部所得質(zhì)粒酶切，連接，重組到含有LacUR-5啟動(dòng)子和四環(huán)素標(biāo)記的載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選，表達(dá)。第九頁，共三十五頁，2022年，8月28日生長(zhǎng)激素釋放抑制因子基因工程生長(zhǎng)激素釋放抑制因子來自哺乳動(dòng)物的下丘腦。主要抑制生長(zhǎng)素、胰島素、胰高血糖素等多種激素的產(chǎn)生，可以用于治療肢端肥大癥、胰腺炎、糖尿病等。將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子基因連在pBR322上并加上了乳糖操縱子調(diào)控，重組分子含有氨芐青霉素抗性以及乳糖發(fā)酵標(biāo)記?；虍a(chǎn)物不易被細(xì)胞內(nèi)源性酶消化。將人工合成的生長(zhǎng)激素抑制因子基因轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞，并得到了基因產(chǎn)物，這是人類首次實(shí)現(xiàn)了真核基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)。第十頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素基因工程

胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素,體內(nèi)胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的。在人體十二指腸旁邊，有一條長(zhǎng)形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布著許許多多的細(xì)胞群，叫做胰島。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。作用機(jī)理屬于受體酪氨酸激酶機(jī)制。第十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素這類活性蛋白多肽和細(xì)胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立體結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，體外難以人工合成。

所以過去糖尿病患者只能服用從牛、豬體中提取的胰島素來治療；但牛、豬胰島素結(jié)構(gòu)上與人胰島素有差別，如與豬胰島素B鏈第30個(gè)基酸殘基不同，長(zhǎng)期服用會(huì)引起腎和眼的疾病，故必需要用基因工程方法獲得重組人胰島素進(jìn)行治療。胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共26種51個(gè)氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵。第十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日第十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素立體結(jié)構(gòu)第十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素的性質(zhì)

〖化學(xué)本質(zhì)〗蛋白質(zhì)

〖分子式〗C257H383N65O77S6

〖分子量〗5807.69

〖性狀〗白色或類白色的結(jié)晶粉末

〖熔點(diǎn)〗233℃（分解）

〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/LNaOH)

〖溶解性〗在水、乙醇、氯仿或乙醚中幾乎不溶；在礦酸（無機(jī)酸）或氫氧化堿溶液中易溶

〖酸堿性〗兩性，等電點(diǎn)pI5.35-5.45

胰島素的英文縮寫，INS.（insulin）第十五頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)1955年英國F.桑格小組測(cè)定了牛胰島素的全部氨基酸序列1965年9月17日，中國科學(xué)家人工合成了具有全部生物活力的結(jié)晶牛胰島素，它是第一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)胰島細(xì)胞根據(jù)其分泌激素的功能分為以下幾種：①B細(xì)胞(β細(xì)胞)，約占胰島細(xì)胞的60%～80%，分泌胰島素，胰島素可以降低血糖。②A細(xì)胞(α細(xì)胞)，約占胰島細(xì)胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升糖素作用同胰島素相反，可增高血糖。③D細(xì)胞，約占胰島細(xì)胞總數(shù)的6%～15%，分泌生長(zhǎng)激素抑制激素第十六頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素生物合成的控制基因在第11對(duì)染色體短臂上。在β細(xì)胞的細(xì)胞核中，第11對(duì)染色體短臂上胰島素基因區(qū)DNA向mRNA轉(zhuǎn)錄，mRNA從細(xì)胞核移向細(xì)胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)譯成由105個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的前胰島素原。前胰島素原經(jīng)過蛋白水解作用除其前肽，生成86個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)肽鏈——胰島素原。胰島素原隨細(xì)胞漿中的微泡進(jìn)入高爾基體，經(jīng)蛋白水解酶的作用，切去31、32、60三個(gè)精氨酸連接的鏈，斷鏈生成沒有作用的C肽，同時(shí)生成胰島素，分泌到β細(xì)胞外，進(jìn)入血液循環(huán)中。未經(jīng)過蛋白酶水解的胰島素原，一小部分隨著胰島素進(jìn)入血液循環(huán)。第十七頁，共三十五頁，2022年，8月28日第十八頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素的分類動(dòng)物胰島素：從豬和牛的胰腺中提取，兩者藥效相同，但與人胰島素相比，豬胰島素中有1個(gè)氨基酸不同，牛胰島素中有3個(gè)氨基酸不同，因而易產(chǎn)生抗體半合成人胰島素：將豬胰島素第30位丙氨酸，置換成與人胰島素相同的蘇氨酸，即為半合成人胰島素生物合成人胰島素：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同第十九頁，共三十五頁，2022年，8月28日胰島素基因的克隆表達(dá)鼠胰島素原cDNA連在pBR322上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克??；人的胰島素DNA將A肽和B肽的DNA片段分別于pBR322相連，通過對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化兒進(jìn)行克??；鼠胰島素使用PL啟動(dòng)子，基因產(chǎn)物為融合蛋白，在β-內(nèi)酰胺酶信號(hào)肽的作用下，穿過胞膜分泌到胞外。人胰島素使用β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子，表達(dá)融合蛋白β-半乳糖苷酶-A肽，β半乳糖苷酶-B肽，經(jīng)溴化氫處理后，得A肽與B肽，通過雙硫鍵的結(jié)合，成為成熟的人胰島素分子。第二十頁，共三十五頁，2022年，8月28日α-淀粉酶基因工程α-淀粉酶普遍應(yīng)用于食品、釀造、輕工業(yè)紡織、造紙、制藥等工業(yè)中。熱穩(wěn)定α-淀粉酶已逐步取代中溫α-淀粉酶，并由微生物進(jìn)行生產(chǎn)。通過基因工程的手段，將地衣芽孢桿菌的熱穩(wěn)定α-淀粉酶基因轉(zhuǎn)移到枯草桿菌中，可以顯著提高產(chǎn)量。第二十一頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十二頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十三頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十四頁，共三十五頁，2022年，8月28日第二十五頁，共三十五頁，2022年，