植物抗病基因工程的基本原理與方法

關(guān)于植物抗病基因工程的基本原理與方法第一頁，共十五頁，2022年，8月28日1植物抗病基因工程策略1.1導(dǎo)入植物抗病相關(guān)基因和病原菌致病相關(guān)基因在植物抗性基因的利用方面

◆根據(jù)已有的R基因結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計新的R基因。

◆異源表達R基因。

◆向同一株植物中導(dǎo)入多個R基因。在病原菌無毒基因的利用方面

轉(zhuǎn)病原菌無毒基因。

將病原菌無毒基因和相應(yīng)的R基因一起導(dǎo)入植物。

導(dǎo)入與植物抗病信號有關(guān)的基因。第二頁，共十五頁，2022年，8月28日1.2導(dǎo)入植物防衛(wèi)基因

◆Broglie(1991),etal.在克隆菜豆幾丁質(zhì)基因的基礎(chǔ)上將CH5B基因修飾改造，通過Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草，獲得幾丁質(zhì)酶高效表達的轉(zhuǎn)基因植株，具有協(xié)同拮抗枯萎病菌的效果。

◆M.J.Carmona(1993),etal.，將來源于大麥基因組克隆的硫素基因和來源于小麥cDNA克隆的硫素基因轉(zhuǎn)化到煙草中，獲得了對P.s.pv.tabaci具有較高抗性的植株。

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美國孟山都（Monsanto）公司將真菌編碼葡萄糖氧化酶基因?qū)腭R鈴薯中，獲得了對Ecc引起的細菌性軟腐病具有良好抗性的植株。第三頁，共十五頁，2022年，8月28日1.3導(dǎo)入降解病原物致病因子基因

◆H.Anzai(1989),etal.分離到了抗煙毒素（tabtoxin）的基因ttr，將基因ttr與CaMV35S啟動子融合成嵌合基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入煙草，獲得ttr高表達量的轉(zhuǎn)基因植株，對煙毒素和病原菌的侵染均表現(xiàn)出良好的抗性。

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菜豆毒素（phaseolotoxin）是一種非寄主?；远舅兀a(chǎn)菜豆毒素的P.s.pv.phaseolicola菌株通過argK基因合成一種不被菜豆毒素抑制的OCTaseR酶，從而對該毒素不敏感。將argK基因?qū)霟煵莺筒硕?，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草和菜豆對P.s.pv.phaseolicola有較高的抗性。第四頁，共十五頁，2022年，8月28日1.4導(dǎo)入其它蛋白基因

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賈士榮,等(1993)和M.Hassan(1993),etal.向馬鈴薯導(dǎo)入cecropin基因后提高了馬鈴薯對青枯病的抗性。

◆J.M.Jaynes(1993),etal.將cecropinB基因?qū)霟煵莺螳@得的轉(zhuǎn)基因植株，提高了其對R.solanacearum引起病害的抗性。

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黃大年,等(1997)將cecropinB和cecropinD基因?qū)胨居着?，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株可明顯地提高對水稻白葉枯病的抗性，同時也獲得了高抗水稻條斑病和水稻白葉枯病的高抗品系。第五頁，共十五頁，2022年，8月28日2植物抗病基因工程的技術(shù)環(huán)節(jié)

◆至今已分離的供植物基因工程應(yīng)用的目的基因有100多個，其中研究得比較多的是抗病毒、細菌和真菌的基因，能殺死害蟲或使害蟲拒食的基因，能抵抗各種除草劑的基因，能抗逆境如干旱、高寒、高溫鹽堿等的基因，能提高植物體中蛋白質(zhì)含量或蛋白質(zhì)品質(zhì)的基因等等。這些基因中有些是來自植物本身，有些來自微生物，還有少數(shù)是人工合成的。第六頁，共十五頁，2022年，8月28日2.1目的基因的分離和鑒定

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對已知序列進行分子克隆

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從蛋白質(zhì)到基因序列

PCR擴增構(gòu)建cDNA文庫構(gòu)建基因組文庫

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與已知基因緊密連鎖基因的分離

第七頁，共十五頁，2022年，8月28日

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根據(jù)植株或細胞表型變異進行基因分離

轉(zhuǎn)座子標簽法圖位克隆法基因挽救技術(shù)基因組相減法cDNA差式顯示轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入細胞目的形狀突變株構(gòu)建核DNA文庫用轉(zhuǎn)座子序列作探針進行雜交分析轉(zhuǎn)座子兩側(cè)序列并以此作探針野生型細胞核DNA構(gòu)建核DNA文庫完整的目的性狀基因轉(zhuǎn)座子標簽法流程圖第八頁，共十五頁，2022年，8月28日2.2表達載體的構(gòu)建

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目的基因分離后，往往需要經(jīng)過修飾才能應(yīng)用于植物基因工程。構(gòu)建植物表達載體就是在目的基因的5’端加上啟動子，在基因的3’端加上中止子，以便使外源基因能在植物中有效地表達，充分發(fā)揮其功能。加入啟動子區(qū)

目前植物基因工程中外源基因常選用的啟動子主要有3類：第一類是從Ti質(zhì)粒的T-DNA序列上分離的啟動區(qū)。具有真核生物轉(zhuǎn)基因起始所需的TATA盒和CAT盒；第二類是CaMV的35S和19S啟動子；第三類是從植物本身分離出來的啟動子。第九頁，共十五頁，2022年，8月28日加入轉(zhuǎn)錄的加尾序列

真核生物為保證一個結(jié)構(gòu)基因表達完全末端需要有一個加尾序列。其功能一方面保證轉(zhuǎn)錄的終止；另一方面保證形成有活性的mRNA鏈。植物基因工程中常用的加尾序列是AATAAA。插入內(nèi)含子

內(nèi)含子是真核生物基因組結(jié)構(gòu)的特點之一。在基因工程中，多數(shù)不用在目的基因中插入這種片段就能得到有效的表達，因此，認為它是基因產(chǎn)物功能非必需的。但是在實際操作中，如果在目的基因適當?shù)奈恢貌迦脒@種序列，其表達量可以提高幾十到幾百倍。因此，有人推測，內(nèi)含子可能在基因翻譯中起增強子的作用。第十頁，共十五頁，2022年，8月28日加入翻譯起始密碼子

由于植物中mRNA的翻譯起始密碼子多數(shù)也是AUG，因此，要在目的基因功能蛋白的編碼序列前加上適當?shù)暮塑账嵝蛄?。加入終止密碼子

植物基因工程中所使用的mRNA翻譯終止密碼子有UAA、UAG、UGA三種。一般在目的基因功能蛋白的編碼序列后直接加上對應(yīng)的堿基序列。實驗中通常采用的是Ti質(zhì)粒中的Nos終止子。加入增強序列第十一頁，共十五頁，2022年，8月28日加入與植物中特定DNA同源的序列

為了實現(xiàn)將目的基因和植物基因組有效整合，植物基因工程中常在目的基因兩端接上能和植物特定基因能整合的DNA序列，一方面可以提高外源基因的插入效率；另一方面也可以結(jié)合植物基因組表達調(diào)控規(guī)律，通過調(diào)整所加同源序列的堿基序列有效地控制外源基因的插入位點和表達時間，使目的基因更便于操作以及整合后更好地發(fā)揮作用。加入報道基因

常用的報道基因：lacZ、ocs、cat、nptⅡ、lux和gus第十二頁，共十五頁，2022年，8月28日2.3目的基因向植物的轉(zhuǎn)化

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近年來，植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，已建立了多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，如以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)化學(xué)導(dǎo)入法、電激法、基因槍法、花管導(dǎo)入法等等?？傊?，植物細胞遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可分為兩大類：以載體為介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化（vectormediatedgenetransfer）和DNA直接轉(zhuǎn)化（nakedDNAtransfer）。

第十三頁，共十五頁，2022年，8月28日2.4轉(zhuǎn)化植物細胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的鑒定

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植物外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌或DNA直接轉(zhuǎn)化后，大部分細胞是沒有轉(zhuǎn)化的，只有極少數(shù)是轉(zhuǎn)化的，這就需要采用特定的的方式將未轉(zhuǎn)化細胞與轉(zhuǎn)化細胞區(qū)分開來，淘汰未轉(zhuǎn)化的細胞，然后利用植物細胞的全能性在適宜的環(huán)境條件下使轉(zhuǎn)化的細胞再生成可育的轉(zhuǎn)基因植株。

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目前，轉(zhuǎn)化細胞與非轉(zhuǎn)化細胞的區(qū)分及非轉(zhuǎn)化細胞的淘汰