納他霉素發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

納他霉素的發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化及檢測(cè)（廣州大學(xué)生物工程系，廣州510006）摘要：本實(shí)驗(yàn)利用褐黃孢鏈霉菌斜面菌種，先取約5個(gè)接種環(huán)的斜面菌種無(wú)菌接種到2瓶種子液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，再分別在無(wú)菌條件下用移液槍吸取1mL種子培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到6瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵48小時(shí)后，連續(xù)3天吸取菌液進(jìn)行鏡檢，菌液OD值測(cè)定，并利用500μg/mL的納他霉素按照0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL加入量制定標(biāo)準(zhǔn)曲線；搖瓶發(fā)酵5天后，合并發(fā)酵液，離心獲得菌泥，采用2倍菌泥體積的95%酒精，pH值在10~10.5攪拌溶解納他霉素；離心保留上清液，上清液在Ph值在6.5，冰箱靜置3h，納他霉素在等電點(diǎn)析出；離心，保留產(chǎn)物；產(chǎn)物在55℃真空干燥2h，稱重獲得0.08g的納他霉素。關(guān)鍵詞：褐黃孢鏈霉菌；種子培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基；等電點(diǎn)溶解；真空干燥引言：納他霉素是一種多烯烴大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，其分子是一種具有活性的環(huán)狀四烯化合物，含3個(gè)以上的結(jié)晶水，其外觀白色（或奶油色），為無(wú)色、無(wú)味的結(jié)晶粉末，分子式C33H47NO13，分子量為665.73。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，難溶于大部分有機(jī)溶劑。在pH值高于9或低于3時(shí)，其溶解度會(huì)有所提高。納他霉素具有一定的抗熱處理能力，在干燥狀態(tài)下相對(duì)穩(wěn)定，能耐受短暫高溫（100℃）；但由于它具有環(huán)狀化學(xué)結(jié)構(gòu)、對(duì)紫外線較為敏感，故不宜與陽(yáng)光接觸。納他霉素活性的穩(wěn)定性受PH值、溫度、光照強(qiáng)度和氧化劑及重金屬的影響，所以產(chǎn)品應(yīng)該避免與氧化物及硫氫化合物等接觸[]。納他霉素(Natamycin)是由一種納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,能有效地抑制和殺死霉菌及酵母菌,是一種安全、低毒、高效、廣譜的抗真菌抗生素和天然的生物防腐劑[1]與其它抗菌產(chǎn)品相比,納他霉素對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性極低,可廣泛應(yīng)用于由真菌引起的疾病.除此之外,納他霉素的低溶解度,可用其對(duì)食品表面進(jìn)行處理以增加食品的保質(zhì)期,不影響風(fēng)味和口感.目前,全球有30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)將納他霉素用于乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒等的生產(chǎn)和保藏[2]。納他霉素的需求量增加,市場(chǎng)前景巨大。納他霉素主要由恰塔努加鏈霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatu2lonso)和褐黃孢鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus)產(chǎn)生。在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)液中各成分的濃度和類型都會(huì)影響納他霉素的生物合成，其中碳氮比是最關(guān)鍵的因素之一，氮源促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)要在發(fā)酵中流加補(bǔ)充適當(dāng)?shù)奶荚?。納他霉素在以葡萄糖最為碳源時(shí)產(chǎn)量最高[3]。因?yàn)槠咸烟悄軌驖B入納他霉素分子之中[3]。氮源類型對(duì)納他霉素的產(chǎn)量有較大的影響。有資料表明，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)最好的氮源是酵母提取物，而納他霉素產(chǎn)生的最佳氮源為牛肉浸出物[3]。1.實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1材料：1.1.1發(fā)酵菌種：褐黃孢鏈霉菌1.1.2培養(yǎng)基：孢子斜面培養(yǎng)基：酵母提取粉4g/L，麥芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L，瓊脂20g/L；pH7.0搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L；pH7.0搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆分離蛋白19.5g/L，麥芽糊精50g/L，酵母提取粉4g/L葡萄糖6g/L，pH7.01.1.3實(shí)驗(yàn)試劑：酵母提取粉，葡萄糖，瓊脂，蛋白胨，氯化鈉，大豆分離蛋白，麥芽糊精，酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化劑BHA，1，2-丙二醇，納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品；1.1.4實(shí)驗(yàn)儀器：250mL三角瓶，搖床，生化培養(yǎng)箱，離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)。1.2方法：1.2.1孢子的制備：按斜面孢子培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配好培養(yǎng)基，121℃滅菌15min,擺斜面冷卻后置于37℃培養(yǎng)1～2d，備用，用斜面轉(zhuǎn)接管接種，25℃培養(yǎng)10d，待孢子長(zhǎng)滿后，放置冰箱5d以上再用。涂片觀察孢子形態(tài)，并顯微拍照。搖瓶種子制備：按搖瓶種子培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配好培養(yǎng)基200mL，平分裝在兩個(gè)三角錐瓶中，121℃滅菌25min。待培養(yǎng)基冷卻后，刮取孢子接種搖瓶，每支斜面接種5瓶搖瓶。29℃，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，無(wú)菌取樣，涂片觀察種子菌球形態(tài)，并顯微拍照。1.2.3搖瓶發(fā)酵：按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方準(zhǔn)確配培養(yǎng)基600mL,平分裝在6個(gè)三角錐瓶中，121℃滅菌25min。待培養(yǎng)基冷卻后，取搖瓶種子1mL接種，29℃，200r/min振蕩培養(yǎng)120～168h。每隔24h無(wú)菌取樣，取1mL發(fā)酵液用于測(cè)量其303nm處OD值，另取少量涂片觀察形態(tài)，并顯微照相。303的測(cè)量方法：從接種后第48h開(kāi)始，每隔24h從其中一瓶中取0.5mL發(fā)酵液，加入4.5mL的丙二醇，在搖床上震蕩1h，12000r/min離心10min，取0.5mL上清液，再加4.5mL蒸餾水，搖勻，用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)303nm處測(cè)定光密度。1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取50mg納他霉素，溶于100mL丙二醇，得濃度為500ug/mL的納他霉素原液。按表1制作曲線，橫坐標(biāo)為納他霉素工作溶液濃度，縱坐標(biāo)為OD303的值。（要求相關(guān)系數(shù)R2>0.99）產(chǎn)物濃度計(jì)算公式為：納他霉素含量（mg/L）=X×100×n式中，X為將所測(cè)樣品的濃度，100為樣品處理時(shí)兩次稀釋倍數(shù)之積；表1納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線工作表管號(hào)123456工作溶液濃度/(ug/mL)01020304050納他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/ml109.89.69.49.29OD30300.1370.2990.4170.5560.6691.2.5納他霉素的分離純化：合并全部發(fā)酵液，再12000r/min離心10min。離心前發(fā)酵液的體積與離心后上清液的體積之差即為濕菌泥的體積；加兩倍濕菌泥體積的95%乙醇，20%氫氧化鈉調(diào)pH10～10.5，邊加邊攪拌0.5h（注意一定要調(diào)過(guò)pH后再計(jì)時(shí)），以便納他霉素充分溶解；然后再再12000r/min離心10min，保留上清液，將上清液用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.5，靜置3h（冰箱），以便納他霉素在等電點(diǎn)處沉淀析出；最后再12000r/min離心10min，保留沉淀（產(chǎn)物），將產(chǎn)物置于55℃真空干燥2h，稱重。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果：因按表1中數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值過(guò)大，故實(shí)驗(yàn)時(shí)，在6支工作溶液中各取1mL再加入4mL蒸餾水（此過(guò)程又稀釋了5倍）進(jìn)行OD值測(cè)定，故標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如下表2所示：表2納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)管號(hào)123456工作溶液濃度/(ug/mL)01020304050納他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/Ml109.89.69.49.29實(shí)際工作溶液濃度/(ug/mL)0246810OD30300.1370.2990.4170.5560.669以上表數(shù)據(jù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示：2.1.2發(fā)酵液檢測(cè)結(jié)果：（如表3所示）表3定時(shí)測(cè)量OD值數(shù)據(jù)表培養(yǎng)時(shí)間/h487296144測(cè)得OD3030.0820.1030.1850.256納他霉素濃度（ug/mL）1.0801.3922.6083.6622.1.3菌體鏡檢結(jié)果:(1)斜面菌鏡檢圖片:圖1×40斜面鏡檢圖（孢子）圖2×100斜面鏡檢圖（菌絲）由圖1可知：斜面的放線菌菌落呈放射狀，表面干燥，有干粉。由于接種時(shí)只是刮去了表面孢子，故在較好的生長(zhǎng)條件下，很多組的沒(méi)有成功獲得斜面。由圖1和圖2可知：在培養(yǎng)了一個(gè)星期后的斜面褐黃孢鏈霉菌的孢子繁殖，菌絲呈現(xiàn)斷裂狀?？赡苡捎谔羧r(shí)折斷。由圖1可知：斜面的放線菌菌落呈放射狀，表面干燥，有干粉。由于接種時(shí)只是刮去了表面孢子，故在較好的生長(zhǎng)條件下，很多組的沒(méi)有成功獲得斜面。由圖1和圖2可知：在培養(yǎng)了一個(gè)星期后的斜面褐黃孢鏈霉菌的孢子繁殖，菌絲呈現(xiàn)斷裂狀?？赡苡捎谔羧r(shí)折斷。(2)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后菌體的鏡檢照片:圖5×40種子菌檢圖圖6×100種子菌鏡檢圖圖5：由斜面接種的菌種在種子培養(yǎng)基已經(jīng)生長(zhǎng)，菌液中遍布了生長(zhǎng)初期的放線菌。圖5：由斜面接種的菌種在種子培養(yǎng)基已經(jīng)生長(zhǎng)，菌液中遍布了生長(zhǎng)初期的放線菌。圖6：為100倍的鏡檢，圖片上選取的是一小團(tuán)菌絲球和一些較短的菌絲片段。培養(yǎng)時(shí)間較短，菌絲球較小，菌絲較短。(3)發(fā)酵48h鏡檢結(jié)果:圖7×10發(fā)酵48h鏡檢圖圖8×40發(fā)酵48h鏡檢圖圖9×100發(fā)酵48h鏡檢圖（局部）圖7：密集的紅色斑點(diǎn)和一些因?yàn)楦稍飼r(shí)燒焦的斑點(diǎn)。圖7：密集的紅色斑點(diǎn)和一些因?yàn)楦稍飼r(shí)燒焦的斑點(diǎn)。圖8：菌絲球變得較多，較大，還有很多孢子，菌絲片段。圖9；圖8的放大圖，存在一些小片段菌絲和較小的菌絲球以及一些較大的菌絲團(tuán)。圖9×40發(fā)酵48h鏡檢圖（局部）(4)發(fā)酵72h鏡檢結(jié)果；圖10：比48h的更加密集的紅斑圖10：比48h的更加密集的紅斑圖11：比48h的更加多的菌絲球，更多的菌絲圖12：圖11的局部放大圖。大菌絲球和較小的菌絲團(tuán)也一些斷裂的菌絲并存。圖10×10發(fā)酵72h鏡檢圖圖11×40發(fā)酵72h鏡檢圖圖12×40發(fā)酵72h鏡檢圖（局部）(5)發(fā)酵96h鏡檢結(jié)果:圖13×40發(fā)酵96h鏡檢圖圖14×40發(fā)酵96h鏡檢圖（局部）圖13：密集的大菌絲球，小菌絲球和菌絲片段圖13：密集的大菌絲球，小菌絲球和菌絲片段圖14：菌絲球更大，菌絲片段(6)發(fā)酵144h鏡檢結(jié)果:圖15×10發(fā)酵144h鏡檢圖圖16×40發(fā)酵144h鏡檢圖（局部）圖15：較明顯的紅色斑點(diǎn)圖15：較明顯的紅色斑點(diǎn)圖16：菌絲球最大，菌絲明顯，菌絲發(fā)散，有一些分開(kāi)了的較小的菌絲球和孢子2.1.4納他霉素分離純化結(jié)果：如下表4所示:表4產(chǎn)物分離純化結(jié)果發(fā)酵液總體積/mL離心后上清液體積/mL濕菌泥體積/mL產(chǎn)物干重/g535.0497.0380.082.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2.2.1由納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線可知：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性系數(shù)為0.9975，線性關(guān)系比較強(qiáng)。制備濃度梯度的納他霉素的校準(zhǔn)液操作比較規(guī)范，測(cè)定OD值過(guò)程比較規(guī)范。2.2.2隨著發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，納他霉素的生產(chǎn)量逐漸增多。隨著發(fā)酵液的消耗，褐黃孢鏈霉菌菌量不多增多。而納他霉素的產(chǎn)生是非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，故在發(fā)酵72h之前，納他霉素產(chǎn)量變化較??；72h~144h的產(chǎn)量變化較大。2.2.3由褐黃孢鏈霉菌發(fā)酵過(guò)程鏡檢圖可知：種子培養(yǎng)基的鏡檢菌絲球較少，小菌絲較多。隨著發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)，發(fā)酵液中菌絲球不斷增大，菌絲增多，孢子產(chǎn)生。褐黃孢鏈霉菌發(fā)酵為好氧發(fā)酵，在搖瓶發(fā)酵過(guò)程，菌體會(huì)形成菌絲球。隨著菌體生長(zhǎng)，菌絲球增大，生長(zhǎng)后期，菌體變老，孢子增多。2.2.4合并發(fā)酵液后，發(fā)酵總體積減少了65Ml,應(yīng)該是菌泥濃縮，菌體生長(zhǎng)消耗產(chǎn)生。菌泥體積為38Ml,體積相比較其他組的適中，產(chǎn)物干重為0.08g，相對(duì)其他組較多。納他霉素的產(chǎn)量與種齡，接種初始Ph,發(fā)酵溫度以及接種量，裝液量等相關(guān)。⑴根據(jù)參考文獻(xiàn)：通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定搖瓶培養(yǎng)條件為:初始pH值7.3,裝液量30mL/300mL,接種量10%,種齡40~44h,溫度28℃,轉(zhuǎn)速200r/min,發(fā)酵120h后測(cè)定其發(fā)酵結(jié)果(見(jiàn)圖6).結(jié)果表明納他霉素產(chǎn)量在發(fā)酵120h時(shí)達(dá)到最大值3.72g/L;DCW在96h達(dá)到最大值29.1g/L。本實(shí)驗(yàn)初始pH值為7.0，裝液量100/mL/300mL，接種量1%，種齡為24h，溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間約144h，納他霉素產(chǎn)量為0.08g/600Ml。⑵本實(shí)驗(yàn)的納他霉素發(fā)酵沒(méi)有達(dá)到最優(yōu)，當(dāng)然相對(duì)于其他組的產(chǎn)量約為中上。各組之間的實(shí)驗(yàn)操作差異主要在接種和培養(yǎng)基上。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配置過(guò)程營(yíng)養(yǎng)損失，pH調(diào)節(jié)等比較合適。接種量和種齡可能存在較少的差