雞場實驗室常規(guī)檢測課件

瑞普生物養(yǎng)殖場實驗室常規(guī)檢測瑞普生物技術(shù)部診斷試驗室電話：概述細菌對抗菌藥物的敏感試驗抗體檢測（HA/HI）細菌性藥敏試驗

細菌性疫病的發(fā)生特點1．疫病復雜化，條件性細菌病的危害加大

據(jù)生產(chǎn)實踐，條件性致病菌在良好的飼養(yǎng)環(huán)境和有效的防疫措施下，基本上不會帶來危害。但在某些疫病感染或防疫條件不良的情況下，就會誘發(fā)疫病。2．癥狀復雜化，給疫病診斷帶來一定困難

近年來，畜禽疾病的普遍表現(xiàn)是癥狀復雜化，表現(xiàn)為某些細菌性疫病與病毒病并發(fā)感染或繼發(fā)感染，構(gòu)成多病因性疾病，使疫病診斷更加復雜化。多病原的并發(fā)或繼發(fā)感染，使疫病的快速準確的診斷與有效防治變得越來越困難。3．濫用抗生素，導致大量耐藥菌株產(chǎn)生

一些養(yǎng)殖場由于缺乏科學飼養(yǎng)技術(shù)和獸醫(yī)診療知識，對臨床動物疫病很難進行針對性治療，一旦發(fā)病，多用抗生素、抗病毒類藥物進行盲目治療，治標不治本，極易造成病情延誤，甚至干擾腸道內(nèi)正常微生物菌群，失去微生物的互相制約作用，致使某些非致病菌大量繁殖，引起“二次感染”；更嚴重的是，由于濫用抗生素導致大量耐藥菌株產(chǎn)生，給疫病治療帶來困難。另一方面，由于飼料廠家為了提高飼料的疾病預防作用，在飼料中添加不同成分的的抗菌藥物，加速了飼養(yǎng)動物的抗藥性產(chǎn)生，尤其是某些雞場由于長期使用土霉素等，使大腸桿菌、沙門氏菌等細菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性，一旦發(fā)生大腸桿菌病、沙門氏菌病，這類藥物即失去了治療作用。細菌性藥敏試驗紙片擴散法肉湯試管稀釋法含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴散，形成遞減的濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細菌的生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小。細菌性藥敏試驗原理:（1）敏感（sensitive）：指被測菌株所引起的感染可以用常用劑量的某種抗菌藥物治愈。（2）中度敏感（moderatesensitive）：指通過提高某種抗菌藥物的劑量或在該藥物濃集的部位，細菌生長可被抑制，感染被治愈。（3）中介度（intermediate）：這一范圍是“緩沖域”，是由操作上的誤差造成的，不作為報告形式。如確需明確該藥的敏感度，需重復試驗或做稀釋法敏感試驗。（4）耐藥(resistance)：指被測菌株所引起的感染不能用該抗菌藥物治愈。（5）最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration)：抗菌藥物能夠抑制細菌生長所需要的最低濃度。單位：μg/ml或U/ml。（6）最低殺菌濃度(minimalbacteriacidleconcentration)：抗菌藥物殺滅細菌所需要的最低濃度。單位：μg/ml或U/ml。細菌性藥敏試驗藥敏試驗中所用的專用名詞觀察紙片周圍有無抑菌環(huán)形成，并測量其直徑大小，以判定細菌對藥物的敏感程度，記錄和報告結(jié)果。判定標準：實驗條件不同，判定標準有所不同。對于一般抑菌環(huán)的直徑，20mm以上極敏;15mm以上者為高度敏感；10-15mm為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán)者為耐藥。

紙片擴散法中，最常用的質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923和銅綠假單胞菌ATCC27853。細菌性藥敏試驗細菌性藥敏試驗瓊脂擴散法①將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別接種于瓊脂平板上（密集劃線法）。②用蠟筆在平皿底面將其分為4個區(qū)域，分別標記抗生素的名稱。③用滅菌后的鑷子夾取各種抗生素濾紙片，平放至培養(yǎng)基表面的相應位置。④置37℃培養(yǎng)24h，測量濾紙片周圍的抑菌圈的直徑。

細菌性藥敏試驗1.標記分區(qū)底部觀細菌性藥敏試驗3.貼片頂部觀

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上。細菌性藥敏試驗4.培養(yǎng)置37℃溫箱，倒置培養(yǎng)18h細菌性藥敏試驗5.結(jié)果觀察細菌藥敏片抑菌圈青青青青細菌性藥敏試驗Kirby-Bauer法試驗程序（a）挑取菌落（b）轉(zhuǎn)種肉湯（c）比濁（d）涂布平板上（e）放置藥敏片（f）量取抑菌圈大小細菌性藥敏試驗細菌性藥敏試驗常用藥敏試驗紙片判斷標準抗菌藥物紙片含藥量(μg/mL)抑菌圈直徑(mm)

不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素500≤1010～26≥26鏈霉素5000≤1010～15≥15氯霉素7000≤1010～20≥20新霉素3000≤1010～25≥25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。影響藥敏結(jié)果的因素

1.培養(yǎng)基：應根據(jù)試驗菌的營養(yǎng)需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養(yǎng)皿，傾注培養(yǎng)基18-20ml為宜。培養(yǎng)基內(nèi)應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質(zhì)，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥。

2.細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產(chǎn)酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

3.藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結(jié)果，需精確配制。商品藥應嚴格按照其推薦治療量配制。

4.培養(yǎng)時間：一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃8-18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2-4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。細菌性藥敏試驗血凝（HA）現(xiàn)象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,雞,豚鼠等動物RBC。原理：血凝素與RBC表面相應受體結(jié)合，引起RBC凝集；用途：①滴定病毒的血凝效價，為血凝抑制試做準備；②確定病毒的存在；凝集效價：能使血球產(chǎn)生++凝集的病毒最高稀釋度為病毒的凝集效價，在病毒血凝抑制試驗中，一般用4個血凝單位?？贵w檢測（HA/HI）血凝抑制（HI）現(xiàn)象：血凝素抗體使病毒失去凝集紅細胞能力的現(xiàn)象。作為臨床檢測試驗，可用于檢測血清中抗體含量或鑒定病毒。稱為血凝抑制試驗。原理：Ab與血凝素結(jié)合，封閉血凝素，使之不能與RBC結(jié)合，凝集RBC。用途：①測定雞群的相應Ab—診斷；②鑒定V的型、亞型；③流行病學調(diào)查：雞群感染情況（Ab）、檢測流行株（V）；血凝抑制效價：能完全抑制血球凝集的最高血清稀釋度即為該血清的血凝抑制效價?？贵w檢測（HA/HI）實驗材料針頭

9*13（采雛雞）、9*25（采大雞）抗原

新城疫（ND）、減蛋（EDS）、流感（AI）抗原，從正規(guī)廠家進。1%紅細胞

非免疫雞心臟采血或免疫雞也可，但需離心5次后使用。檸檬酸三鈉

配制3.8％抗凝劑用重鉻酸鉀

配制清潔液用硫酸

配制清潔液用

蒸餾水

當?shù)刭I。清洗96孔V型板、吸頭用稀釋液：0.1MPBS

做血清稀釋液用、配制4單位抗原抗體檢測（HA/HI）實驗材料抗體檢測（HA/HI）0.1MPBS離心機抗體檢測（HA/HI）1%紅細胞的制備實驗材料抗體檢測（HA/HI）實驗材料微量加樣器冰箱抗體檢測（HA/HI）單位：微升孔號123456789101112①PBS252525252525252525252525②抗原252525252525252525252525抗原稀釋212223242526272829210211③RBC1%252525252525252525252525振蕩器震蕩1-2min，置室溫感作30min。結(jié)果+++++++++++++++++++++++++++++++-結(jié)果觀察反應板傾斜45℃，對照成立的情況下，孔底紅細胞向下呈線狀流動者表示不凝集；反之，傾斜后不流動則表示被凝集。HA操作抗體檢測（HA/HI）HA陽性HA陰性HA試驗抗體檢測（HA/HI）4單位抗原的驗證HI操作單位：微升孔號123456789101112①PBS252525252525252525252525②被檢血清252525252525252525252525血清稀釋212223242526272829210211212③4單位Ag252525252525252525252525振蕩器震蕩1-2min，置20-22℃感作20min。④RBC1%252525252525252525252525振蕩器震蕩1-2min，置20-22℃感作30min。結(jié)果---------++++++結(jié)果觀察

反應板傾斜45℃，對照成立的情況下，孔底紅細胞向下呈線狀流動者表示血清中的抗體抑制了病毒（4單位Ag）對紅細胞的凝集；反之，傾斜后不流動則表示病毒（4單位Ag）凝集了紅細胞，即血清中無相應Ab?？贵w檢測（HA/HI）商品肉雞檢測時機常規(guī)檢測：1）1d母源抗體，考察種代健康情況及確定免疫時間；2）35-42日齡，測定出欄前機體抗體情況。發(fā)病雞群：發(fā)病后一周免疫試驗或疫苗對比試驗：每周采血化驗種雞/蛋雞檢測時機常規(guī)檢測：每4周一次發(fā)病雞群：發(fā)病后一周抗體檢測（HA/HI）一般認為，活苗免疫后2w到達抗體高峰，油苗免后3w到達抗體高峰。采樣的比例：按每個舍0.6%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常規(guī)采樣15-30份即可。

采樣的具體要求

(1)每個雞舍應分至少五個點隨機采樣。采血的量要適當,一般在1-1.2ml左右(4/5管)為宜。如果采血量不足,可能不夠完成所有的化驗項目。

(2)采血時應注意采出的血液應沿著采血管管壁慢慢注入管內(nèi)，切忌用力過猛起泡造成溶血。

(3)剛采好的血要避免受冷和振動，應在25-37℃環(huán)境中加蓋靜置1-2h，這樣有利于血液凝固和析出血清。靜置后立即送檢，如不能及時送檢。須放入4℃冰箱保存（不宜超過24h），切忌冰凍。

(4)血樣運輸時盡可能直立，避免灑漏?？贵w檢測（HA/HI）正常1）商品肉雞母抗≤28，有時可達29，一般情況下母抗較種代雞低2個滴度。2）種雞/蛋雞2個月時可達26-8

，甚至更高，多次免疫也不會超過212。3）通常一旦建立免疫保護，HI抗體維持2個月不會有大變動，抗體波動不會超過2個滴度。4）正常情況下，育成期或產(chǎn)蛋期的油苗免疫一次可以提升1.5-2個滴度，否則就是免疫失敗，則應加免?？贵w檢測（HA/HI）ND-HI態(tài)勢評價發(fā)病1）未免疫雞群的抗體出現(xiàn)陽性。2）發(fā)病后2w的ND-HI至少比發(fā)病前高2個滴度，個別可能異常高。3）肉雞或育雛的種雞/蛋雞發(fā)病后10d，ND-HI可上升5個滴度到210

。4）種雞/蛋雞場野毒感染1個月后，個別的滴度可達214

或更高。5）生物安全措施良好的雞場往往存在野毒的滾動感染，因此雞場的病程往往持續(xù)數(shù)月之久。如確診的早，可從遠離發(fā)病舍的（假定）健康雞舍做緊急免疫?？贵w檢測（HA/HI）ND-HI態(tài)勢評價數(shù)據(jù)的意義抗體檢測（HA/HI）抗體滴度：個體抵抗力GMT：平均值，顯示群體的平均抵抗力CV%：變異系數(shù)(標準差S/平均值X)，代表群體相對與平均值的離散程度。但活苗免后抗體的轉(zhuǎn)陽率遠比該參數(shù)重要。CV%均勻度<40%優(yōu)異40-60%良好>60%需改善抗體檢測（HA/HI）免疫雞群血清ND-HI抗體水平與保護力的關(guān)系：ND-HI滴度雞群接觸到VVNDV后的情況注<4Log2死亡臨界值。50%以上的死亡率，可達100%。免疫抗體4-7Log290%以上的保護率。>6Log2能抵抗呼吸道感染,仍有少數(shù)雞死亡。8Log2100%保護，但產(chǎn)蛋雞群產(chǎn)蛋下降。9-10Log2產(chǎn)蛋安全臨界值。11-13Log2NDV仍可在雞體內(nèi)復制。>13Log2不再出現(xiàn)NDV復制（不發(fā)生感染）強毒感染后的抗體抗體檢測（HA/HI）日齡疫苗劑量途徑0dC30+H1201XSpr8dND+H9（RP）0.3mlSC11d新支妥1.2XDW16d法必妥1XDW23d新必妥2XDW抗體檢測（HA/HI）影響檢測結(jié)果的因素紅細胞懸液濃度來源于不同個體雞的紅細胞，對抗原的敏感性不盡相同。因此實驗時最好用3-4只未免疫雞。配制紅細胞時，紅細胞