江南大學(xué)《食品酶學(xué)》1-4章課件

1、食品酶學(xué)Food Enzymology 王璋王淼第一章 引言 第一節(jié) 食品酶學(xué)課程的歷史和現(xiàn)狀為什么要在食品科學(xué)學(xué)科中設(shè)置食品酶學(xué)這門課程自上世紀(jì)80年代起一系列的高新技術(shù)被應(yīng)用在食品加工和保藏，促進(jìn)了食品工藝的發(fā)展。生物技術(shù) biotechnique微膠囊技術(shù) microencapsulation膜分離技術(shù) membrane separation 分子蒸餾技術(shù) molecular distillation 超臨界流體提取技術(shù) supercritical fluid extraction超高溫瞬時殺菌技術(shù) ultra temperature instant sterilization高壓殺菌技

2、術(shù) high pressure sterilization 脈沖殺菌技術(shù) pulse sterilization 歐姆殺菌技術(shù) electric resistance sterilization無菌包裝技術(shù) aseptic package微波技術(shù) microwave technique復(fù)合包裝技術(shù) complex package materials冷凍干燥技術(shù) freeze dry technique可食用膜技術(shù) edible film technique氣調(diào)保藏技術(shù) controlled atmosphere storagew其他 others technique 在各項技術(shù)中列在首位的是生

3、物技術(shù)，它可以分為兩代。第一代技術(shù)： 酶的生產(chǎn)和使用 通過誘變劑（mutants）篩選和改良菌種 通過發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)過程實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)變第二代技術(shù)： 基因工程 gene engineering 單克隆抗體 monoclonal antibodies 生物傳感器 biosensors高果糖 玉米糖漿 酶在分析中的應(yīng)用寡肽、低聚糖的制造 土豆保藏中酶作用對土豆加工性能的影響天然風(fēng)味料的加工 食品材料在低溫保藏中控制酶活力的重要性澄清果汁的加工 蛋白質(zhì)的酶法改性啤酒穩(wěn)定性的提高 提高從天然資源中提取某種組分時的提取率與碩士和博士研究生學(xué)位論文研究工作的關(guān)系以生物材料作為加工或研究對象的食品學(xué)科，酶學(xué)的原

4、理（知識）已是期望成為食品科學(xué)家的學(xué)生必須掌握并會運用的基本原理。主要參考材料Principles of Enzymology For the Food Science John R. Whitaker 第一版 1972 第二版 1994Fundamentals of Enzymology Nicholas C. Price 第二版 1989Enzymes in Food Processing Tilak Nagoda Withana，Gerala Reed 1966 1975 1993（第三版）Industry Enzymology Tony Godfrey 1983 1996 第二版Foo

5、d ChemistryOwen R. Fennema 1996 第三版 第7章 P431P530Source Book of Food EnzymologySigmund Schnimmer 1981食品酶學(xué) 王璋 1990Food Enzymes Structure and MechanismDominic W.S. Wong 1995Hand Book of Food EnzymologyJohn R. Whitaker 2003 ,Marcel Deker , Inc. New York第二節(jié) 酶的簡短歷史最近70多年來酶學(xué)繼續(xù)得到快速發(fā)展酶學(xué)的簡短歷史酶的發(fā)現(xiàn)1833 Payen an

6、d Persoz在麥芽提取物的乙醇沉淀物中發(fā)現(xiàn)熱不穩(wěn)定物質(zhì)，它能將淀粉轉(zhuǎn)變成糖，后來此物質(zhì)被稱為amylase，當(dāng)時它被命名為diastase，這是因為它有能力從淀粉顆粒的不溶性封皮中將可溶性糊精分離出來amylase 淀粉酶diastase 淀粉酶制劑在19世紀(jì)中期發(fā)現(xiàn)了過氧化氫酶（catalase）、胃蛋白酶（pepsin）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase）、過氧化物酶（peroxidase）和轉(zhuǎn)化酶（invertase）酶的特異性（Enzyme Specificity）1894 Fischer提出lock-and-key的酶和底物相互作用的概念1959 Koshland提

7、出酶底物結(jié)合的誘導(dǎo)楔合概念Koshland保留了Fischer的概念即酶和底物之間形成立體有擇絡(luò)合物的概念，而拒絕了酶的活性部位的結(jié)合部位是剛性結(jié)構(gòu)的概念速度和反應(yīng)的定量表示1902年Henri和Brown各自提出了飽和曲線1913年Michaelis和Menten推導(dǎo)出數(shù)學(xué)表達(dá)式V=Vmax(A)Km + (A)開發(fā)了一系列純化酶的方法ion exchange cellulosepolyacrylamide gel as stabilizing media for electrophoreticseparations of enzymesgel filtrationaffinity chro

8、matographyisoelectric focusingchromatofocusing chromatographyhydrophobic interaction chromatography酶的結(jié)構(gòu)1955年Sanger等報導(dǎo)胰島素的氨基酸序列（順序），MW6,0001963年核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)被測定，MW13,683采用Xray crystallography測定了ribonuclease，lysozyme，chymotrypsin，trypsin，papain和carboxypeptidaseA的三級甚至四級結(jié)構(gòu)1969年ribonuclease的完全化學(xué)合成目前可利用recom

9、binant DNA techniques合成酶，前提是gene能被分離出來開創(chuàng)了一個新的方法測定酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系在下述兩個領(lǐng)域取得重大進(jìn)展：采用化學(xué)法和體外誘變法把酶的氨基酸側(cè)鏈改性，定量解釋上述改性對酶的催化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。闡明酶能如此高效的執(zhí)行它們的功能的詳細(xì)機制第三節(jié)酶的一般特征An enzyme is a protein with catalytic properties due to its power of specific activation.酶是蛋白質(zhì)holoenzymeApoenzymeLow molecular weight organic compoundMet

10、al ionNonprotein part CofactorFigure4酶是催化劑催化劑是一種能影響化學(xué)反應(yīng)的速度而自己又沒有作為反應(yīng)的產(chǎn)物出現(xiàn)的物質(zhì)在理想的情況下催化劑不會被消耗然而，甚至無機催化劑像鈀和鉑，也會中毒，于是實際上是被消耗的但是，酶在失去它的活力（由于失活或副反應(yīng)）之前已催化大量底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 第十頁公式酶的作用是加速平衡的到達(dá)，即提高速度常數(shù)k1和k2，而不能改變k1/k2=KegIn vitro酶的濃度在10-8 to 10-6M，In vivo酶的濃度要高的多酶的效率用周轉(zhuǎn)數(shù)（turnover number）表示，對于水解酶，它在101102（sec1）范圍，對于氧化還

11、原酶它在106107（sec1）范圍。周轉(zhuǎn)數(shù)的定義：在酶被底物飽和的情況下，1 mole活性酶在1 sec（或min.）內(nèi)將底物的多少mole數(shù)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。Figure5目前可利用recombinant DNA techniques合成酶，前提是gene能被分離出來開創(chuàng)了一個新的方法測定酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系在下述兩個領(lǐng)域取得重大進(jìn)展：采用化學(xué)法和體外誘變法把酶的氨基酸側(cè)鏈改性，定量解釋上述改性對酶的催化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響。闡明酶能如此高效的執(zhí)行它們的功能的詳細(xì)機制maltase maltose glacose (-glucoside) -1,4-糖苷鍵 cellobiase cellobiose

12、 glucose (-glucoside)-1,4-糖苷鍵 上述兩個酶所催化水解的鍵僅存在微小的差別。酶對食品、營養(yǎng)品和保健科學(xué)的重要性食品科學(xué)家需要了解酶的本質(zhì)在成熟的植物組織中出現(xiàn)酶的活動和數(shù)量的增加，淀粉轉(zhuǎn)變成糖，葉綠素降解和細(xì)胞尺寸的快速增加。在沒有氣調(diào)的條件下水果會變得過熟和軟糊。最易控制的參數(shù)是溫度和底物。把產(chǎn)品貯存在較低的溫度可以推遲產(chǎn)品變得不能被接受的時刻的到來。然而，并非把原料的貯存溫度控制得越低，它們的貯存期越長。這方面的實例是馬玲薯的貯存。高溫 Starch dextrin maltose glucose oxidation Potato softening低溫 star

13、ch sugar sugar oxidationpotato unacceptable sweet browing of fried potato chip Maillard reaction caramelization reaction 在0或比0稍低導(dǎo)致組織中酶活力增加的原因：1.水溶液相被濃縮2.細(xì)胞被大的冰結(jié)晶破碎決不要在05條件下保存食品，除非期望提高酶的活力。In 1960, Emil Mark, in his introductory address to a symposium on food enzymes held at Oregon State University,

14、sounded the call for more fundamental work on enzymes by the food scientist.Truly, the most fundamental work on enzymes is of interest to food technologists and belongs in a department of food technology just as much as in a department of biochemistry. Both groups should be working on enzymes; howev

15、er, the point of view may be different. The biochemist seeks knowledge of the enzymes whereas the food scientist working in the fundamental area of enzymology will always have in the back of his/her mind the use or control of these systems, yet the contribution of the two groups might be similar. By

16、 obtaining a thorough knowledge pertaining to the fundamentals of these reactions, we can do more in the way of preserving and producing better foods.If we are to progress in our treatment of foods, in our production of better foods and the preservation of more foods, and if we are to create wealth

17、by preservation, then we must get down to an understanding of the more fundamental aspects of enzymes. It is only the departments of food technology that look at these fundamental aspects that will make real progress in the future.(From Ref.38,pp.4 and 5,by courtesy of Avi Publishing Co.) 第二章 酶的蛋白質(zhì)本

18、質(zhì)所有的酶都是蛋白質(zhì)，但并非所有的蛋白質(zhì)都是酶蛋白質(zhì)具有一級、二級、三級、四級結(jié)構(gòu)以及大分子組織形式第一節(jié) 一級結(jié)構(gòu)已從不同的天然來源分離出175種以上20種在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。有些蛋白質(zhì)僅由氨基酸組成，被稱為簡單蛋白質(zhì)（simple protein），像核糖核酸酶、胰凝乳蛋白酶。另一些蛋白質(zhì)由氨基酸和有機化合物和/或無機離子組成，被稱為結(jié)合蛋白質(zhì)（conjugated protein）。結(jié)合蛋白質(zhì)：色蛋白（chromoprotein）非血色素金屬蛋白（non-heme metalloproteins）脂蛋白（lipoprotein）糖蛋白（glycoprotein）磷蛋白（phosphoprot

19、ein）需要各種輔助因子的酶Table 1 Some Uses and Suggested Uses of Enzymes in Foods and Food Processing鐵卟啉（iron-porphyrin）作為輔助因子（cofactor），像血紅蛋白（hemoglobin）肌紅蛋白(myoglobin) 過氧化氫酶(catalase) 過氧化物酶(peroxidase)非血色素金屬蛋白（non-hememetalloproteins）像鐵蛋白（ferritin）羧肽酶A和B(carboxypeptidases A和B) 堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）乙酸脫氫酶

20、(alcohol dehydrogenase)脂蛋白（lipoprotein）糖蛋白（glycoprotein）磷蛋白(phosphoprotein) 像酪蛋白(casein) 胃蛋白酶(pepsin)需要各種輔助因子的酶氨基酸和它們的性質(zhì)除脯氨酸（proline）和羥脯氨酸(hydroxyproline)外都是-氨基酸；除甘氨酸(glycine)外，都具有不對稱C，具有光學(xué)活性，都是L-型（L-configuration）；蘇氨酸羥基脯氨酸(hydroxyproline)異亮氨酸(isolencine)羥基賴氨酸(hydroxy-lysine)具有兩個不對稱C(asymmetric carb

21、on)等電點的概念（Isoelectric point） HendersonHasselbalch EquationpH=pK+log(A-/HA)當(dāng)酸的50%離解時，pK=pH谷氨酸和天門冬氨酸具有兩個酸性基團(tuán)賴氨酸精氨酸和組氨酸具有兩個堿性基團(tuán)，其實組氨酸分子中的咪唑基（imidazole）具有兩性（含有羥基的氨基酸SerThr，酚羥基Tyr ，含巰基氨基酸Cys）二氨基酸相互作用形成肽鍵 C*為不對稱C，具有四面體結(jié)構(gòu)肽鍵未能完全伸展，如完全伸展，兩個氨基酸殘基長度為8.64 ，實測為7.23 。R基團(tuán)在平面上下交叉地配置第二節(jié) 二級結(jié)構(gòu)在-螺旋結(jié)構(gòu)中，任何相對移動都需要打破至少連續(xù)三個

22、氫鍵主鏈圍繞著中心軸旋轉(zhuǎn)而側(cè)鏈向外伸展，殘基n的C=O基和（n+1）殘基的NH基形成氫鍵；每一殘基過渡到次一殘基在X軸方向移動1.5，移動100；每圈螺旋由36個殘基構(gòu)成，螺距為5.4。-Pleated sheet不同肽鏈之間或同一肽鏈的不同部位側(cè)向的氫鍵締合 平行和反平行兩種形式NCCNCCNCCNCC 平行（parallel） NCCNCC CNNCCN 反平行（antiparallel）第三節(jié) 三級結(jié)構(gòu) 大多數(shù)酶近似地呈球狀 Myoglobin：8個-螺旋片斷，它們包括了118/153氨基酸殘基，其他為非螺旋結(jié)構(gòu)；它們進(jìn)一步以復(fù)雜的非規(guī)則的方式折疊成緊密的三棱柱，453525 ,幾乎所有

23、極性氨基酸殘基在表面，幾乎所有的非極性殘基在分子內(nèi)部，親水基暴露在溶劑水中，而疏水基盡可能的離開水。三級結(jié)構(gòu)中的鍵：帶相反電荷基團(tuán)之間的靜電作用（electrostatic bonds）氫鍵（Hydrogen bond）疏水鍵（Hydrophobic bond）偶極鍵（dipolar bond）二硫鍵（disulfide bond） 其中二硫鍵是最穩(wěn)定的鍵。含有二硫鍵的胞外低分子量蛋白質(zhì)一般來說是十分耐變性的。-amylase雖不含有二硫鍵，但仍較穩(wěn)定。其原因是含有Ca2+，它幫助維持三級結(jié)構(gòu)。還原劑能打破二硫鍵-S-S- 蛋白質(zhì)分子中某些鍵的能量和距離（相互作用的距離）類型 能量 (千焦/摩

24、爾)共價鍵125-418離子鍵42-84氫鍵 8-40范氏引力 4-12第四節(jié) 蛋白質(zhì)的水化（Hydration）所有蛋白質(zhì)都具有三級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)分子直接接觸的第一層水分子與蛋白質(zhì)分子間的作用較強烈，隨著距離增加，水分子受蛋白質(zhì)的影響減弱。直接測定被蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子的數(shù)量是相當(dāng)困難的，一個原因是它并非恰好是一個單層；要確定離蛋白質(zhì)分子多遠(yuǎn)，水分子不再受蛋白質(zhì)分子影響同樣是困難的。對于球蛋白，被固定的水為0.2-0.3克H2O/克蛋白質(zhì)，對于分子量為18,000的蛋白質(zhì)，每分子蛋白質(zhì)能固定200-300 H2O分子。Random coiled protein, such as gelatin,

25、 can immobilize as much as 99 times their weight of water (4) due to entrapment of water inside a thatch work of random coild protein molecules.水分子并非均勻分布在蛋白質(zhì)分子表面而是集中在較親水的區(qū)域，所以在水溶液中蛋白質(zhì)分子的形狀部分地取決于水在它表面的結(jié)合。第五節(jié) 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)許多酶僅由一條肽鏈組成，例如，核糖核酸酶 (ribonuclease)，溶菌酶 (lysozyme)，胰蛋白酶 (trypsin)，胃蛋白酶 (pepsin)，-淀粉酶

26、(-amylase)有大量酶和蛋白質(zhì)由二個以上的多肽鏈組成，即形成四級結(jié)構(gòu)血紅蛋白 (Hemoglobin) 2和2鏈組成乳酸脫氫酶 (Lactate dehydrogenase) 4條多肽鏈組成，即含兩種不同類型的多肽鏈，H4, H3M, H2M2, HM3, M4The two type of subunits can be separated. The catalytic subunits are fully active alone but there is no allosteric behavior of the enzyme in the absence of the regul

27、atory subunits.四級結(jié)構(gòu)中的鍵四級結(jié)構(gòu)中不包括二硫鍵 (-S-S-)疏水鍵和相反電荷基團(tuán)的靜電作用起著主要的作用疏水側(cè)鏈結(jié)合的百分?jǐn)?shù)超過30% 具有四級結(jié)構(gòu)疏水側(cè)鏈結(jié)合的百分?jǐn)?shù)少于30% ，沒有四級結(jié)構(gòu)，是一條多肽鏈第六節(jié) 酶的大分子組成 (Macromolecular organization of enzyme)酶以兩種形式存在 完全溶解 膜結(jié)合在電子輸送過程中的酶系有規(guī)則地結(jié)合在一結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)上。當(dāng)使用洗滌劑將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)與酶分開時，酶系失去電子輸送能力可溶態(tài)酶以有組織狀態(tài)存在的例子較少丙酮酸脫氫酶復(fù)合物 (Pyrurate Dehydrogenase Complex)從E.

28、 Coli 分離出來具有粒重量4.44million，由三種酶組合而成E124丙酮酸脫羧酶 (Pyrurate Decarboxylase)每分子的M. W. = 90,000 此分子由兩條不同的多肽鏈組成E224二氫硫辛酸脫氫酶 (Dihydrolipolyl Dehydrogenase) 每分子的M. W. = 55,000E38硫辛酸乙酰移換酶 (lipoyl trans acetylase)每分子的M. W. = 120,000 此分子由三條多肽鏈組成它們催化的總反應(yīng)：CH3COCO2+CoASH +NAD CH3CoSCoA+CO2+NADH大分子組織的重要性整個過程的效率改變（增加

29、）整個過程在更為有控制的情況下進(jìn)行底物和中間產(chǎn)物在最終產(chǎn)物釋放前可能被結(jié)合復(fù)合物被環(huán)境因子激素和變構(gòu)因子所控制There is some evidence that aggregation of enzymes produces complexes which have activities unlike any of the enzymes separately. In a complex, the overall efficiency of the process can be altered. Since the substrate and intermediates appear to

30、 remain bound until the final product is released. Such a process could allow increased efficiency and more control over the rate of reaction since the complex is probably subject to control by environmental factors including hormones and allosteric effectors.第三章 酶的提取和純化第一節(jié) 酶純化的必要性在食品加工過程中常需要將原料熱處理以

31、使酶失活。測定上層清液中的某種最耐熱的酶的殘余酶活力以判斷熱處理條件是否恰當(dāng)。本實驗的目的僅需要了解還有多少酶活殘剩下來，不需要對酶的性質(zhì)作進(jìn)一步研究，此種酶萃取液稱為crude extract。直接從crude extract 中測定酶的活力的條件是酶對底物有較高的特異性，得到上清液后就不需要將感興趣的酶作進(jìn)一步純化。如果許多酶作用于同一底物，那么從上述步驟得到的數(shù)據(jù)顯然不能作為判斷熱處理程度的標(biāo)準(zhǔn)或依據(jù)。檢查一個酶液中蛋白酶的活力，用一個普通蛋白質(zhì)作為底物所得到的結(jié)果可能是多種蛋白酶活力的綜合結(jié)果。當(dāng)然，也可以不經(jīng)分離而采取一些措施分別測定個別酶的活力。例如：一酶液中含有胰蛋白酶和胃蛋白酶

32、 pH 2 8 胰蛋白酶活力 無 有 胃蛋白酶活力 有 無也可以采用特異性底物底物 N-acetyl-L-tyrosine ethyl ester -N-benzoyl-L-arginine ethyl ester胰蛋白酶 無 有胰凝乳蛋白酶 有 無這個例子也僅僅是為了得到酶活力的數(shù)據(jù)，而且也是較粗略的，即使這樣，有時還需要考慮將某些抑制劑分離出去。測定過氧化物酶活力時，crude extract中的還原性化合物對酶具有抑制作用。 如果需要研究一個酶的氨基酸組成、分子量、三級結(jié)構(gòu)、底物特異性、動力學(xué)參數(shù)，那么必須將酶和其他物質(zhì)完全分開，即純化。第二節(jié) 酶的提取材料的選擇取決于研究工作的類型。研

33、究某種酶，不管它的來源，那么選擇某種材料，其中含有大量該種酶即可以，例如從Horseradish 提取peroxidase， 因為horseradish是已知的含peroxidase最多的植物。如果需要研究一種特定材料中的特定的酶，則沒有選擇的余地，例如研究蘑菇中的多酚氧化酶。從微生物培養(yǎng)改變生長介質(zhì)的成分能誘導(dǎo)產(chǎn)生某種需要的酶，例如，細(xì)菌在僅含有maltose作為唯一碳源的介質(zhì)中生成，可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生高濃度的maltase.酶濃度隨生物體的年齡而變化。聚半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移消去酶的活力（Bacillus Pumilus）Activity of Polygalacturonic acid trans-

34、eliminase(PATE) from Bacillus Pumilus在植物中，某些酶存在于綠色水果中，而不是存在于成熟水果中，例如papay的papain；某些酶不存在于綠色水果中，而存在于成熟水果，例如tomato中的pectin enzyme。酶的分布（Localization of enzyme）水果和蔬菜：酶集中在表面或核附近。 從某一選擇的部位中酶的濃度或許是10-100倍高于整個組織。一個部位的酶不同于另一個部位。細(xì)胞含有亞細(xì)胞器溶菌體、線粒體、核、細(xì)胞膜；differential centrifugation methods are available for separa

35、ting the various organelles of the cell;亞細(xì)胞水平的分級能導(dǎo)致酶的1020倍的富集。酶的提取冰浴、冷室和冷凍離心機是必需的設(shè)備。大多數(shù)的酶在0左右是穩(wěn)定的，微生物的生長是遲緩的。如已得到均漿，應(yīng)該盡快地進(jìn)行下一步工作，如不得不推遲，可蓋一薄層甲苯，以防止微生物污染。將細(xì)胞和膜破碎以便將酶從組織中萃取出來。制備丙酮粉兩個原則：（1）將細(xì)胞破裂，將酶徹底地萃取到緩沖液。（2）低溫快速以防止酶的變性或失活。對可溶態(tài)酶（soluble enzyme）采取低離子強度。對離子結(jié)合態(tài)酶（ionic bound enzyme）采取高離子強度。對共價結(jié)合態(tài)酶（covale

36、nt bound enzyme）采用纖維素酶處理。果蔬材料中含有酚類化合物，在提取時可加入polyvinylpyrrolidone 或ethylene glycol 以除去這些酚類化合物。如果組織中同時含有大量蛋白酶，除了在低溫下快速工作外，可加入具選擇性的抑制劑。除去核酸如果組織中含有大量核酸，它會干擾蛋白質(zhì)（酶）分離，如有必要應(yīng)在此階段除去。方法：調(diào)節(jié)pH至5.0, 或加入堿性化合物產(chǎn)生沉淀 使用deoxyribonuclease或ribonuclease，但需注意因加入的酶制劑不純所造成的污染。熱處理根據(jù)各種酶蛋白質(zhì)對熱的不同穩(wěn)定性，可以適當(dāng)?shù)臒崽幚矸椒?，將一些不耐熱的酶蛋白質(zhì)除去。當(dāng)然

37、，所需要回收的酶必須較耐熱的。第三節(jié) 純化蛋白質(zhì)（酶）之間性質(zhì)上的差別溶解度（solubility）電荷密度(charge density)電荷分布(charge distribution)水合(hydration)大小(size)形狀(shape)密度(specific volume)特殊反應(yīng)基團(tuán)(special reaction group)相對穩(wěn)定性(relative stability )分離蛋白質(zhì)（酶）的方法（技術(shù)）就是根據(jù)上述這些性質(zhì)設(shè)計的。二、分離方法下表總結(jié)了分離蛋白質(zhì)（酶）的主要方法。 酶純化中的主要分離方法性質(zhì) 方法 規(guī)模 離心 大或小大小或質(zhì)量 凝膠過濾 小 透析、超濾（

38、納米濾、 小微濾、反滲透） 電荷 離子交換色譜 大或小 電泳 小 等電聚焦（聚焦色譜） 小溶解度 改變pH 大 改變離子強度 大或小 降低介電常數(shù) 大特殊結(jié)合位置 親和色譜 小 親和洗提 大或小疏水性 疏水相互作用 小三、主要分離方法的概述沉淀技術(shù)吸附作用absorbent gel Aluminium hydroxide和tricalcium phosphate 吸附劑凝膠 氫氧化鋁 磷酸三鈣離子交換色譜（Ion exchange chromatography） The criteria be used in selecting a gradient is that it changes th

39、e least in the region where the desired protein is being eluted. The best resolution is obtained when the gradient is zero in this region. 一般地說，在離子交換色譜中，柱的尺寸不是非常重要的。如被分離的蛋白質(zhì)質(zhì)量較大，可用較大直徑的柱。柱的長度一般地說對分辨率影響不大。在stepwise gradient 洗脫中，如鹽濃度每次變化將得到一個蛋白質(zhì)峰，那么柱的長度對分辨的重要性是不大的，如果多于一個峰，那么柱長將影響結(jié)果。并非desired物質(zhì)總是被吸附在柱上

40、，如desired物質(zhì)具有極端的pI，則讓其它組分被吸附在柱上而讓desired物質(zhì)通過柱收集起來，一次即可達(dá)到相當(dāng)大程度的純化。柱的長度一般地說對分辨率影響不大。在stepwise gradient 洗脫中，如鹽濃度每次變化將得到一個蛋白質(zhì)峰，那么柱的長度對分辨的重要性是不大的，如果多于一個峰，那么柱長將影響結(jié)果。并非desired物質(zhì)總是被吸附在柱上，如desired物質(zhì)具有極端的pI，則讓其它組分被吸附在柱上而讓desired物質(zhì)通過柱收集起來，一次即可達(dá)到相當(dāng)大程度的純化。凝膠過濾色譜（Gel filtration chromatography）電泳(Electrophoresis)聚

41、焦色譜(chromatofocusion)親和色譜（Affinity chromatography）和親和洗提(Affinity elution)在親和色譜中，象底物或競爭性抑制劑那樣的分子通過共價鍵與惰性載體（例如瓊脂糖）相連接，形成親和載體。這些分子和需要純化的酶之間具有特異性的相互作用。當(dāng)混合物通過填充有親和載體的柱子時，僅此種酶保留在柱子中，其它的酶和蛋白質(zhì)被洗出柱子。然后加入底物，憑借此時它對酶分子結(jié)合部位的競爭作用，或者改變?nèi)芤旱膒H或離子強度，削弱酶對親和載體的結(jié)合，都可以使結(jié)合的酶解吸。整個過程如圖所示親和洗提是互補于親和色譜的一項技術(shù)。對于親和色譜，相互作用的特異性表現(xiàn)在吸附

42、階段上；對于親和洗提相互作用的特異性從色譜的支持材料解吸這一階段。在親和洗提中，有意義的酶（蛋白質(zhì)）和其他化合物一起首先吸附到一種離子交換劑上（如DEAE-纖維素），然后用適當(dāng)?shù)牡孜锾禺惖叵刺帷Ｋ?、酶純化步驟的設(shè)計目標(biāo)和準(zhǔn)則 (Aims and criteria)目標(biāo)：如果要研究一個酶（蛋白質(zhì)）的組成或氨基酸殘基的次序，它必須純化到homogeneous，如果要研究它的結(jié)構(gòu)和功能，還必須保持他的天然狀態(tài)。準(zhǔn)則：酶（蛋白質(zhì)）分離需要滿足下列諸條件：所要求的純度，高回收率，方法的經(jīng)濟(jì)性。初步知識：應(yīng)盡可能的了解被純化的酶（蛋白質(zhì)）以及試樣的性質(zhì)。并不是一定要知道一個被分離的酶（蛋白質(zhì)）的全部細(xì)節(jié)，

43、有些性質(zhì)要在它被分離后才能完全清楚。然而，它的個別性質(zhì)對于將要采用的一些分離方法還是很重要的。例如：sizegelfiltrationchargedensityionexchangebiological propertiesaffinity chromatography所采取步驟的順序純化步驟的順序從理論上講是不重要的，只要能達(dá)到最終除去雜質(zhì)的目的，各個步驟編排的順序是無關(guān)緊要的。然而，兩個步驟之間的連接是重要的，因為一個步驟對試樣性質(zhì)的影響，將會決定那一個步驟必須接著跟上，這就是所謂兩個相鄰步驟的compatibility。例如：dialysis or gelfiltration 會稀釋樣品

44、，跟著的下一步驟應(yīng)是具有濃縮作用的步驟。例如：salt precipitation 后，sample 中鹽的濃度太高，因而不能采用ionexchange chromatography，如想采用必須先安排一部脫鹽步驟。例如：在開始階段必須處理大量樣品，因此，high capacity 是優(yōu)先考慮的，而high resolution 可放在后期考慮。整個分離程序中應(yīng)包括根據(jù)不同的selectivity 的步驟例如：根據(jù)分子大小分離的步驟不能除去雜質(zhì)，可再用根據(jù)電荷性質(zhì)不同的分離步驟進(jìn)一步純化。整個酶（蛋白質(zhì)）純化的過程分為幾個階段初步純化選擇性純化步驟檢查純化的進(jìn)展情況進(jìn)一步純化五、純化步驟的定量

45、評價（Quantitation of purification steps）每一步驟是否成功必須測定酶的活力和蛋白質(zhì)含量，同時比較它們。酶的活力用unit/ml表示。測定酶的活力可任意選擇一種方法，但必須讓他人便于重復(fù)。蛋白質(zhì)濃度表示方法是mg/ml。比活力是指 酶活力/蛋白質(zhì)濃度比活力（某一步后）Purification data should be kept in a balance skeet (見“食品酶學(xué)”參考教材 p58 表3-3)純化過程中蛋白質(zhì)的損失是無關(guān)緊要的，而酶活力的損失是至關(guān)重要的。當(dāng)然，酶活力的損失是不可避免的。How much loss of enzyme can

46、be tolerated will depend upon how much starting material is available and how much enzyme is needed at the end。純化倍數(shù)不是一個純度的指標(biāo)，這取決于在初始材料中酶的百分含量。酶的百分含量純化倍數(shù)純度20% 5 pure0.1% 861 86.1% pure 第四章 活性部位和影響酶催化的因素第一節(jié) 酶活性部位的本質(zhì)活性部位分為結(jié)合部位和催化部位（binding locus and trans forming locus）沒有催化仍能產(chǎn)生結(jié)合，沒有結(jié)合則不能產(chǎn)生催化。一、活性部位的結(jié)合部

47、位（binding locus）酶是非常特異的（專一的）。底物結(jié)構(gòu)的微小變化會導(dǎo)致酶無能力轉(zhuǎn)變底物成為產(chǎn)物。Fischer“l(fā)ock and key” model能解釋酶的特異性。根據(jù)此模型，在酶蛋白的表面有一個區(qū)域（一個模板template）和底物結(jié)構(gòu)互補（complementary），互補的本質(zhì)包括size，shape和/或電荷。當(dāng)一個分子能和這個模板區(qū)域完全互補，它將能結(jié)合到酶上去。當(dāng)?shù)孜锏囊鬃兓I（susceptible bond）適當(dāng)?shù)囟ㄏ虻矫傅拇呋课?，底物能轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。二、活性部位的揉性(flexibility)經(jīng)典的“l(fā)ock and key”模式和許多實驗數(shù)據(jù)是有矛盾的。Ko

48、shland提出“induced fit”模式：（a）當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合到酶蛋白質(zhì)上去時，酶的空間結(jié)構(gòu)有一個相當(dāng)大的變化 （b）催化基團(tuán)精確的定向?qū)Υ呋饔玫漠a(chǎn)生是必要的 （c）底物誘導(dǎo)此適當(dāng)?shù)亩ㄏ蚴峭ㄟ^它所引起的酶空間結(jié)構(gòu)的變化而實現(xiàn)的。三、酶底物的結(jié)合效率并非所有的酶底物絡(luò)合物都能轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，只有當(dāng)絡(luò)合物能將底物上易受進(jìn)攻的鍵配置到緊靠著催化基團(tuán)的位置，它才能轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物。四、活性部位的催化部位底物中易受進(jìn)攻的鍵必須配置到催化部位的催化基團(tuán)，這些催化基團(tuán)由構(gòu)成酶的氨基酸殘基的某些側(cè)鏈所提供。Serine CysteineHistidine Aspartic acid Glutamic acidlys

49、ineTyrosineArginine 共價中間物的形成在活性部位的某些基團(tuán)參與底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的過程中可能形成酶底物的共價中間物，但并非對所有的酶催化反應(yīng)來說都是如此。可分為兩類：共價結(jié)合中間物非共價結(jié)合中間物共價結(jié)合的實例：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶催化反應(yīng)的中間物曾被分離，它們的性質(zhì)曾被研究。對某些酶來說對輔助因子還有特異性的要求醛縮酶（aldolase）(lysine的-NH2) 磷酸二羥丙酮 Schiffs base（不穩(wěn)定） (穩(wěn)定)五活性部位的大小從酶的一級結(jié)構(gòu)來看，組成活性部位的基團(tuán)并不是處于非?？拷奈恢?；但是當(dāng)形成三級結(jié)構(gòu)時，它們必須處于相互非常接近的位置。多肽鏈其他部

50、份起著保持活性部位適當(dāng)空間結(jié)構(gòu)的作用，也即使這些基團(tuán)合適地配置到活性部位?；钚圆课换鶊F(tuán)中的某一個的相對位置發(fā)生1的幾分之一的改變都可能導(dǎo)致酶的活性部位的破壞，但是有理由相信，酶蛋白的某一部位對酶活力來說是無關(guān)緊要的，如能發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)姆椒?，可將這部分除去而不影響酶的活力。每個酶分子中活性部位的數(shù)目是很小的。一般來說，每一個多肽鏈只有一個活性部位。許多酶只有一條多肽鏈，它們只有一個活性部位。在多肽鏈酶中兩種情況：活性部位數(shù)目和多肽鏈數(shù)目相同；活性部位數(shù)目小于多肽鏈數(shù)目，其中某些多肽鏈執(zhí)行調(diào)節(jié)功能或其他功能。第二節(jié)影響酶催化反應(yīng)效率的因素最顯著的特征是酶能提高反應(yīng)速率幾個數(shù)量級一、接近和定向效應(yīng)（Pr

51、oximity and Orientation Effects）酶催化底物產(chǎn)生變化時，活性部位中的催化基團(tuán)相對于底物的正確定位即所謂的接近和定向?qū)τ谔岣呙复呋磻?yīng)的效率究竟有多少價值。酶在選擇底物上是非常特異的，這個特異性包括活性部位的結(jié)合部位和催化部位對底物的要求。1分子內(nèi)對分子間催化（Intra-versus Intermolecular Catalysis）通過同底物的結(jié)合，酶轉(zhuǎn)變一個分子間反應(yīng)（兩級或更高級）成一個分子內(nèi)反應(yīng)（一級反應(yīng)）分子間反應(yīng) 分子內(nèi)反應(yīng) 反應(yīng)速度因從分子間反應(yīng)轉(zhuǎn)變成分子內(nèi)反應(yīng)而提高1000倍，定向和接近因子使雙分子反應(yīng)速度增加5.5104倍，三分子反應(yīng)速度增加11

52、022倍。2熵對反應(yīng)的影響（Effect of Entropy on Reaction）如果酶和底物相結(jié)合，則反應(yīng)體系的自由度下降，Sground下降，S*增大（相對于沒有酶催化的反應(yīng)體系而言）F*下降或者說活化能下降。胰凝乳蛋白酶催化的反應(yīng)對硝基乙酸苯酯 N乙酰L酪氨酸乙酯 （1）（2）兩個?；饶榈鞍酌该擋；磻?yīng)的活化參數(shù)造成S*在兩個反應(yīng)中差別的原因是當(dāng)bulky N-acetyl-L-tyrosyl基結(jié)合到酶的結(jié)合部位上去之后失去了自由度，而小的乙?；荒苓m合結(jié)合部位，因而仍保留著相當(dāng)?shù)淖杂啥取Ｔ谝粋€體系中熵和幾率具有相同的變化方向。S=klnW 玻茲曼-普朗克公式如體系具有較高的自

53、由度也即有較大的自由度，它的熵值也就比較大。3 反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度在分子內(nèi)反應(yīng)中，由于攻擊基團(tuán)能處于正確的位置，使得反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度比起分子間反應(yīng)來高得多。它的濃度并沒有被反應(yīng)體系整體相的水所稀釋。二 通過扭曲達(dá)到催化（Catalysis by Distortion）結(jié)合部位比底物長0.5，當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合到酶上去時，在A和B基團(tuán)之間的易受攻擊的鍵拉長0.5，導(dǎo)致結(jié)合的底物更加類似于過渡狀態(tài)。結(jié)合過程提供了達(dá)到過渡狀態(tài)中間物所需的活化能的一部分。如結(jié)合部位的尺寸處于底物和產(chǎn)物間的中間范圍，當(dāng)?shù)孜锉唤Y(jié)合時，底物和產(chǎn)物都被扭曲，兩個方向的反應(yīng)速度被加速。三 廣義酸-堿催化反應(yīng)許多酶的活性部位的催化部位

54、含有質(zhì)子移換基團(tuán) prototropic group質(zhì)子移換基團(tuán)有酸性和堿性氨基酸側(cè)鏈Asp和Glu的羧基Tyr的酚羥基Cys的巰基His的咪唑基Ser的羥基Lys的-氨基Arg的胍基C-末端氨基酸殘基的-COOHN-末端氨基酸殘基的-NH2定義: 酸給出一個質(zhì)子的物質(zhì) 堿能接受一個質(zhì)子的物質(zhì)許多催化反應(yīng)包括：質(zhì)子從底物的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置，質(zhì)子在兩個底物之間轉(zhuǎn)移，質(zhì)子在酶的一個質(zhì)子移換基團(tuán)和底物的一個質(zhì)子移換基團(tuán)之間轉(zhuǎn)移。General acid or general base catalysis is used to describe the reaction when the ra

55、te is affected by transfer of protons from one or more of the prototropic groups on the side chain of amino acid residue.如果反應(yīng)速度來自水中的氫離子或羥基離子濃度的影響，由于它們的直接參與，這類反應(yīng)稱為特殊酸或特殊堿催化。四親核和親電催化（Nucleophilic and Electrophilic Catalysis ）親核是一個具有給出電子對強烈傾向的基團(tuán)親電是一個具有接受電子對強烈傾向的基團(tuán)親核催化反應(yīng)速度（總地或部分地）被一步包括電子對從催化劑給于底物的反應(yīng)所控制。

56、親電催化反應(yīng)速度（總地或部分地）被一步包括催化劑從底物接受電子對的反應(yīng)所控制。第三節(jié) 酶作用機制的實例：溶菌酶和羧肽酶一 溶菌酶（Lysozyme）1 溶菌酶作用的底物溶菌酶分解細(xì)胞壁的多糖組分，從而使細(xì)菌溶解，當(dāng)細(xì)胞壁被分解時，由于高滲透壓，整個細(xì)胞解體。細(xì)胞壁中的多糖由兩類單糖組成。N-乙酰葡萄糖基胺（N-acetylglucosamine NAG）和N-乙酰-2-葡萄糖基胺-3-乳酸醚（N-acetylmuramic acid NAM）NAM和NAG以-1，4糖苷鍵交替結(jié)合。 2 溶菌酶作用的化學(xué)鍵溶菌酶催化水解NAM和NAG之間的糖苷鍵而不能催化水解NAG和NAM 之間的糖苷鍵。3 溶

57、菌酶的三維結(jié)構(gòu)溶菌酶是一個較小的酶。溶菌酶（從雞蛋白）含129個AA residues，MW為14600dal。溶菌酶通過4個二硫鍵分子內(nèi)交叉連接，高穩(wěn)定性。用X-ray法測定lysozyme分子的電子云密度，然后確定它的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)緊密（compact），橢圓形（ellipsoidal）453030，比起Myoglobin和Hemoglobin來，具有少得多的-helix，在許多鏈段，肽鏈?zhǔn)巧煺範(fàn)顟B(tài)。其中一個表現(xiàn)為反平行的-pleated sheet結(jié)構(gòu)。大部分極性基團(tuán)在表面，大部分非極性基團(tuán)在內(nèi)部。4 溶菌酶活性部位的發(fā)現(xiàn)掌握了三維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)并不等于搞清楚酶的作用機制。溶菌酶不含有 輔助

58、基團(tuán)，因此沒有活性部位的外加標(biāo)志，這一點是不同于Myoglobin和Hemoglobin。從溶菌酶和抑制劑相互作用的X-ray結(jié)晶圖的研究，我們可獲得必需的資料來確定酶的活性部位，能解釋底物結(jié)合的模型以及酶作用的機制。采用Trimer of N-acetylglucosamine作為競爭性抑制劑。5 競爭性抑制劑的結(jié)合模型Tri-NAG同酶的結(jié)合的位置是在酶表面的一個裂縫，并占據(jù)這條裂縫的一半。Tri-NAG同酶結(jié)合是通過氫鍵和Vander waals interaction，但靜電相互作用是不存在的，因為Tris-NAG不存在離子基團(tuán)。氫鍵 Asp101與residue A和residue

59、B在酶和糖殘基C之間共有四個氫鍵Trp62的咪唑基上的NH-C6上的氧Trp63的咪唑基上的NH-C3上的氧Acetamido側(cè)鏈上的CO和NH同主鏈上氨基酸殘基的NH和CO之間的氫鍵。AcetamidoC=O NH of AA59NH CO of AA107Vander waals contacts6 從結(jié)構(gòu)到酶催化機制(1)底物如何同酶相結(jié)合酶競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)能提供底物結(jié)合到酶上去的關(guān)鍵線索。Tri-NAG僅占據(jù)裂縫的一半，可能其他三個糖基占據(jù)了裂縫的其余部分才能形成E-S complex。Hexamer of N-acetylglucosamin(hexa-NAG)能被酶快速水解，支持

60、了這一假設(shè)。另外三個糖基中的E和F能通過H-bound 和Vander waal contacts 適應(yīng)裂縫，但是糖基中的D由于C6和O6太靠近酶中的某些基團(tuán)，它必須扭轉(zhuǎn)它的正常構(gòu)型才能進(jìn)入裂縫。（2）哪一個鍵是被斷裂的？當(dāng)殘基數(shù)（NAG）從4增加到5時（NAG4NAG5），寡聚體（Oligomers）水解速度顯著增加。當(dāng)?shù)?個NAG加上去時（NAG5NAG6）水解速度進(jìn)一步增加。當(dāng)殘基數(shù)進(jìn)一步增加到8時，水解速度沒有改變，這表明活性部位的裂縫被6個殘基完全占滿。由于TriNAG是穩(wěn)定的，所以鍵A-B和鍵B-C并非斷裂的位置，位置C不能被NAM所占據(jù)，因為NAM由于lactyl使得它顯得太大。