HPLC法測定valrubicin膀胱滴注液的含量及有關物質(zhì)

1、HPLC法測定valrubicin膀胱滴注液的含量及有關物質(zhì)【摘要】目的建立適宜的高效液相色譜法測定valrubiin膀胱滴注液中valrubiin的含量及有關物質(zhì)。方法采用島津Shi-pakVP-DS色譜柱；流動相為0.015l/L磷酸溶液(取磷酸1l，加水稀釋至1000l)乙腈(4357)；柱溫35；檢測波長254n；流速1.5l/in。結(jié)果主藥與雜質(zhì)和或降解產(chǎn)物良好別離，空白油輔料無干擾。以本法檢測樣品中所含0.05%10%范圍的有關物質(zhì)，其線性關系良好；在0.011.18g/l范圍內(nèi)valrubiin濃度與峰面積呈良好的線性關系，合適于含量測定。有關物質(zhì)檢測的LD為0.1g/l，相當于

2、可檢出所有濃度低至0.01%的雜質(zhì)和或降解產(chǎn)物。有關物質(zhì)檢測結(jié)果重復性好；含量測定重復性試驗測得valrubiin平均含量為96.8%(RSD=0.34%，n=9)。Valrubiin含量測定的平均回收率為100.5%(RSD=0.4%，n=9)。結(jié)論本法色譜性能明顯優(yōu)于USP個論方法，專屬性強，更適用于valrubiin膀胱滴注液的含量測定和有關物質(zhì)檢測?！娟P鍵詞】Valrubiin；膀胱滴注液；高效液相色譜法；含量測定；有關物質(zhì)ABSTRATbjetiveTestablishanalternativehighperfraneliquidhratgraphyethdfrthedeterina

3、tinfvalrubiinanditsrelatedsubstanesinvalrubiinintravesialslutin.ethdsTheHPLethdasappliedithaShiadzuShi-pakVP-DS(4.6150,5)lunbyanelutinsystensistedf0.015l/Lphsphateaidslutin(phsphateaid1laddedt1000later)aetnitrile(4357);theflrateas1.5l/in.ThedetetiveavelengthassetatUV210n;thelunteperatureashldat35.Re

4、sultsThegdreslutinbeteenpeaksfvalrubiinandtheadjaentipurityand/rdegradatinprdutasahieved.Theblankexipientnsistedfplyxyl35astrilandethanl(5050)didntinterfereintheseparatinanddetetinfvalrubiin.Thelinearrangefranalysisftherelatedsubstanesfvalrubiininintravesialslutinsaplesas0.05%10%,andthelinearrangefr

5、valrubiinassayingas0.011.18g/l.TheLDftherelatedsubstanesfvalrubiininsiulatedsaplesspikediththeblankexipientas0.1g/l.Theaveragereveryftheethdas100.5%ithRSDf0.4%(n=9);andtheaveragentent96.8%asbtainedfrthepreisintestithRSDf0.3%(n=9).nlusinTheethdsheduhhigherhratgraphiperfraneandspeifiitythantheUSPngrap

6、hiethd.Itssensitive,preise,aurateandrbustfrassayandipurityanalysis.Itsresuitablefrthedeterinatinfvalrubiinanditsrelatedsubstanesinvalrubiinintravesialslutin.KEYRDSValrubiin;Intravesialslutin;HPL;ntentdeterinatin;RelatedsubstaneValrubiin(戊柔比星，AD32)是多柔比星(曾譯阿霉素)的一個半合成同系物，屬水溶性蒽環(huán)類抗生素，能迅速穿透細胞膜并在胞漿中積蓄，治療效果

7、好且毒性小，已被用于治療淺表性膀胱癌。Valrubiin膀胱滴注液1系valrubiin加Plyxyl35astril2和無水乙醇(11)制成的無菌油性溶液，臨床上通過膀胱內(nèi)滴注給藥，用于卡介菌治療無效或復發(fā)的膀胱原位癌的治療，療效明顯且耐受性好，USP28版收載了該品的質(zhì)量標準3。我們對國產(chǎn)試制樣品進展質(zhì)量研究時發(fā)現(xiàn)，USP個論方法尚不完善，被測物色譜行為不理想，該法的系統(tǒng)性能與適用性受到質(zhì)疑；本文在充分論證的根底上，建立了替代的HPL色譜分析方法，用于該品的有關物質(zhì)檢測與含量測定，獲得了滿意的試驗結(jié)果。1儀器與試藥Agilent1100型組合式全自動高效液相色譜儀，包括AgilentG13

8、15BDAD檢測器、AgilentG1313AALS自動進樣器及配套的AgilenthestatinfrL3D化學工作站(Rev.A.10.02)；電子分析天平為SartriusBP211D型；色譜柱為島津公司Shi-pakVP-DS柱(4.6150，5)。乙腈為色譜純；磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%濃過氧化氫溶液均為分析純；水為重蒸水。Valrubiin膀胱滴注液試制樣品四批(規(guī)格為5l200g，批號分別為040801、040901、040902和040903)、valrubiin工作對照品(批號為202207，有效含量為98.0%)、valrubiin粗品和中間體(碘代物)均由浙江海正藥業(yè)股

9、份提供。2方法與結(jié)果2.1測定方法確實立(1)USP方法的評價USP28版收載了valrubiin膀胱滴注液。USP個論方法所訂色譜系統(tǒng)為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1l/L甲酸銨溶液乙腈(5545)(用甲酸調(diào)節(jié)pH值至4.0)為流動相；檢測波長254n；流速2.5l。首先對上述色譜系統(tǒng)的優(yōu)劣性和適用性進展性能評價。取valrubiin工作對照品及中間體(碘代物)，加USP個論方法規(guī)定的溶解介質(zhì)甲醇制成每1l中含中間體為0.1g、含valrubiin1g的加樣試驗溶液，量取10l進樣測試，以2.0l/in的流速洗脫，結(jié)果valrubiin遠至47.9in才出峰，峰起始處逐漸上抬，峰

10、形有明顯前伸；中間體及其引入的其他雜質(zhì)均與valrubiin別離較好，對檢測尚無干擾。為進步分析速度和改善峰形，反復調(diào)試上述色譜系統(tǒng)的流動相比例、流速等色譜參數(shù)，當流動相比例調(diào)至3862、流速降至1.3l/in時，再取上述加樣溶液進樣測試，結(jié)果主峰之前有一雜質(zhì)峰與主峰的別離不佳，別離度僅為1.3；降低流速至1.0l/in，別離度勉強到達1.5；重復進樣數(shù)次，沒有改觀。用內(nèi)容量移液管量取膀胱滴注液適量，加甲醇溶解并稀釋制成約含valrubiin1g/l的溶液，取10l進樣測試，按調(diào)整后的流動相比例以1.0l/in的流速進展洗脫，結(jié)果valrubiin峰在12.3in處流出，峰起始處以3040角逐

11、漸上抬，峰形明顯前伸(Fig.1)。此現(xiàn)象勢必影響積分結(jié)果的準確性。不過該系統(tǒng)尚能檢出一定數(shù)量的雜質(zhì)峰，其中在4.9in處檢出了最大雜質(zhì)峰，在30.8in處檢出了色譜保存最強、疑心與熱降解有關的未知物峰。另取在高溫40環(huán)境下放置10d的膀胱滴注液適量，加甲醇溶解并稀釋成約含valrubiin1g/l的溶液，取10l進樣測試，按調(diào)整后的流動相比例進展試驗，結(jié)果valrubiin峰形與前述現(xiàn)象一致，并發(fā)現(xiàn)2.7、4.9和30.9in處的熱降解物峰明顯增大。再取經(jīng)60放置10d的樣品，同法試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.7、4.9和30.9in處的熱降解物峰又有更明顯增大。因valrubiin色譜峰形的非對稱前伸

12、現(xiàn)象過于明顯且始終無法消除(Fig.1已是USP個論方法優(yōu)化后所能獲得的最正確圖譜)，故放棄USP28版?zhèn)€論的色譜分析方法，改用下述替代的HPL法繼續(xù)進展研究。(2)替代的HPL法色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.015l/L磷酸溶液(取磷酸1l，加水稀釋至1000l)乙腈(4357)為流動相；柱溫35；檢測波長254n；流速為1.5l/in。取本品進展預試驗，結(jié)果獲得了理想的valrubiin色譜峰，主峰與雜質(zhì)、輔料的別離效果也非常理想，并同樣能檢出一個相對保存時間接近于主峰3倍的熱降解物峰(Fig.2)，故以上述色譜條件為根底建立膀胱滴注液有關物質(zhì)檢測和含量測定的HPL法。有關

13、物質(zhì)檢測方法的建立取本品5l，置200l容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得供試品溶液；精細量取1l，置100l容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得自身對照溶液。精細量取上述兩種溶液各10l進樣測試，記錄色譜圖至主成分峰保存時間的3倍。含量測定方法的建立在有關物質(zhì)檢測方法的根底上開展制訂了本品的含量測定方法。用內(nèi)容量移液管精細量取本品適量(約相當于valrubiin200g)，置200l容量瓶中，用流動相分數(shù)次洗滌移液管內(nèi)壁，洗液并入容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，再精細量取5l，置25l容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精細量取10l進樣測定；另取valrubiin工作對照品，同法測定。按外標法

14、以峰面積計算供試品中valrubiin(34H36F3N13)的含量。2.2方法的驗證(1)溶解介質(zhì)的比擬和選擇曾試驗以乙腈為介質(zhì)制備試驗溶液，但發(fā)現(xiàn)本品的乙腈溶液呈輕度渾濁，濾膜過濾未見效，故不選用。因USP個論方法規(guī)定用甲醇制備試驗溶液，故又取甲醇進展試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其溶解效果要明顯好于乙腈，溶液根本澄清，但仍覺不夠清澈透明，濾膜過濾無明顯改觀?？紤]到乙腈、甲醇在反相色譜系統(tǒng)中均屬強溶劑，易引發(fā)溶劑效應，而valrubiin本身對溶劑效應相當敏感，溶解介質(zhì)與流動相之間的差異越大，對色譜行為的影響越明顯，故決定采用新配的、與上機進柱的流動相完全一致的流動相作為溶解介質(zhì)制備試驗溶液。(2)專屬性

15、試驗以強力破壞試驗對本品降解產(chǎn)物的形成規(guī)律和方法的色譜效能進展研究。取本品置4500Lx照度儀下連續(xù)照射10d后取樣測試，結(jié)果色譜圖中強光照射所致降解產(chǎn)物峰的數(shù)量有一定增加，但均與主峰良好別離。取本品在120電烘箱中放置數(shù)小時后取樣測試，結(jié)果色譜圖中高溫破壞所致降解產(chǎn)物峰的數(shù)量明顯增加，局部降解物峰響應較大(45.7in處降解物峰為最大)，而主峰明顯縮小，說明有較大程度降解。各降解產(chǎn)物峰均與主峰完全別離。取本品加6l/L鹽酸溶液適量進展強酸破壞，用6l/L氫氧化鈉溶液終止、中和后取樣測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜圖中有數(shù)量明顯的降解物峰檢出，但大多隨溶劑峰較快流出或在溶劑峰附近流出，另在9.83in處檢出

16、一相對較大降解物峰。各降解產(chǎn)物峰均與主峰良好別離。取本品加6l/L氫氧化鈉溶液適量進展強堿破壞，用6l/L鹽酸溶液終止、中和后取樣測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜圖中有數(shù)量明顯的降解物峰檢出，但大多隨溶劑峰較快流出或在溶劑峰附近流出；主峰響應明顯縮小，說明有較大程度降解。各降解產(chǎn)物峰均與主峰良好別離。取本品加3%過氧化氫溶液進展氧化破壞，室溫下適時放置后取樣測試，結(jié)果色譜圖中檢出了一定數(shù)量的降解產(chǎn)物峰(主峰前后未見檢出)，可見氧化作用所致降解物峰與主峰之間具有良好的別離度。上述各強力破壞試驗結(jié)果說明所建色譜系統(tǒng)可有效檢測各種降解產(chǎn)物，適用于本品的有關物質(zhì)檢測和含量測定。(3)空白干擾試驗用內(nèi)容量移液管量取本

17、品的空白全溶劑適量，加流動相溶解并稀釋制成空白試驗溶液，取10l進樣測試，試驗結(jié)果說明輔料不干擾本品的有關物質(zhì)檢測和含量測定。(4)線性關系研究有關物質(zhì)檢測的線性關系與USP28版?zhèn)€論方法采用HPL面積歸一化法報告有關物質(zhì)的量不同，本文采用相對準確、嚴謹?shù)淖陨韺φ胀鈽朔ǘ繙y算和報告。現(xiàn)對該法的線性關系和線性范圍進展研究。精細稱取valrubiin工作對照品約20g，置100l容量瓶中，加空白全溶劑0.5l，加流動相適量振搖使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成濃度的標準貯備液；分別精細量取適量，加流動相分次分步稀釋制成0.5135、1.0270、2.5676、5.1352、7.7028、10

18、.2704、20.5408、41.0816、51.3520、68.4693及102.704g/l的梯度測試溶液(可視作供試品中含0.05%、0.10%、0.26%、0.51%、0.77%、1.03%、2.05%、4.11%、5.14%、6.85%及10.3%的雜質(zhì))，分別精細進樣10l，記錄色譜圖，結(jié)果對應的主峰面積分別為7.2、14.0、35.0、69.5、105.1、139.9、281.2、564.2、705.5、939.2及1413.0。對上述兩組數(shù)據(jù)進展回歸分析，得線性方程：A=13.7528-0.7564r=0.999998(n=11)提示供試品中含有關物質(zhì)為0.05%10%時，檢測

19、方法具有良好的線性關系。含量測定的線性關系分別精細稱取valrubiin工作對照品適量，各參加處方量的空白全溶劑，用流動相溶解并定量稀釋制成含valrubiin0.01006、0.01972、0.05125、0.10057、0.19718、0.51254、0.80399、1.0057及1.1844g/l的梯度測試溶液，分別精細量取10l進樣，對應的valrubiin峰面積分別為142.4、270.4、708.1、1400.1、2669.8、7070.5、11085.2、13889.0和16330.2。對峰面積(A)和濃度()兩組數(shù)據(jù)進展回歸分析，得線性方程為：A=13798.7-5.33287

20、r=0.999995(n=9)提示在0.011.18g/l的范圍內(nèi)進樣10l，供試品溶液的濃度與主峰面積呈良好的線性關系。(5)靈敏度試驗精細稱取valrubiin工作對照品適量，參加配方量的空白全溶劑，渦旋混勻，制成模擬膀胱滴注液樣品，用內(nèi)容量移液管精細量取適量，加流動相逐級稀釋制成供檢測限測試的一組溶液，分別進樣10l，以信噪比為3來確定為本法的最低檢測濃度(LD)。結(jié)果測得valrubiin的LD為0.1g/l，該值相當于可檢出所有濃度低至0.01%的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，說明方法具有相當高的靈敏度。(6)色譜記錄時間確實定從專屬性試驗項下各強力破壞樣品的色譜圖中，可以發(fā)現(xiàn)本品雜質(zhì)或降解產(chǎn)物中

21、的絕大多數(shù)先于主峰流出，其色譜保存普遍弱于主成分，主峰之后很少有雜質(zhì)檢出，但對脫離冷處保存的樣品或已開啟時間較長的樣品在主峰保存時間約2.7倍處必有一熱降解物峰檢出，因此本品有關物質(zhì)檢測的色譜記錄時間應規(guī)定為至少到達主峰保存時間的3倍。(7)重復性試驗取冷處保存的樣品一批(批號040801)，待平衡至室溫后，依法取樣進展試驗，按自身對照法以峰面積計算大于0.1%的單個雜質(zhì)(5個)及總雜質(zhì)，共測定9份，對有關物質(zhì)檢測方法的重復性進展考察，結(jié)果見Tab.1。試驗結(jié)果說明本法檢測有關物質(zhì)(主要雜質(zhì)與總雜質(zhì))重復性好。另取上述已平衡至室溫的樣品，依法連續(xù)取樣9份測定其中所含主藥valrubiin的含量

22、，對方法的重復性進展考察，結(jié)果平均含量為96.8%，RSD為0.34%(n=9)，說明本法具有良好的重復性。(8)準確性試驗本品組成比擬復雜，為考察輔料對含量測定方法準確性的影響，按處方配比制備不含主藥的空白樣品用于加樣回收率測定。根據(jù)本品工藝，分別按標示規(guī)格(200g)的80%、100%及120%的投料比精細稱取valrubiin工作對照品適量，并按處方配比參加正常量的空白全溶劑，渦旋混合使溶解、均質(zhì)，即制成模擬的膀胱滴注液，依法取樣測定含量；另取valrubiin工作對照品，同法測定，按外標法計算valrubiin的加樣回收率。結(jié)果見Tab.2。平均回收率為100.5%(RSD=0.4%，n=9)，說明本法準確性好。2.3樣品測定取樣品三批(040901、040902、040903)，照上述制定并經(jīng)歷證的方法進展含量和有關物質(zhì)測定，結(jié)果見Tab.3和Fig.3、Fig.4。雜質(zhì)峰，并為之制訂了相應的限度(1個不得過0.5%，3個不得過0.8%)，還規(guī)定了除上述4個特定雜質(zhì)之外的單個雜質(zhì)的限度(不得過0.5%)及總雜質(zhì)的限度(不得過3.5%)。雖然針對性較強，要求較為詳細，但實際操作起來有困難，計算也比擬繁瑣，更突出的問題是利用相對保存時間法定性雜質(zhì)不甚可靠，同一雜質(zhì)的相對保存值在不同色譜儀、色譜柱或不同試驗日、不同實驗室之間容易發(fā)生偏離，從而使雜質(zhì)鑒定出現(xiàn)困難或