基因工程中常用酶

1、關(guān)于基因工程中常用的酶第1頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四一、限制性核酸內(nèi)切酶二、連接酶三、聚合酶四、修飾酶第2頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四基因的剪刀-限制性內(nèi)切酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 (Restriction enzyme)第3頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四核酸酶（P41-42)：切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基間的磷酸二酯鍵導(dǎo)致多核苷酸鏈共價(jià)鍵斷裂的一類水解酶。可分為核糖核酸酶與脫氧核糖核酸酶。按水解斷裂核酸分子的不同方式分：核酸外切酶：以核酸的末端為酶解部位逐個(gè)降解核苷酸核酸內(nèi)切酶：從核酸內(nèi)部水解磷酸二酯鍵使之?dāng)嗔?/p>

2、限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶第4頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四 一. 限制與修飾發(fā)展史: 1962年 Arber, W. (瑞士) 等 提出限制與修飾假說。 1968 Meselson和Yuan 發(fā)現(xiàn)型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox 發(fā)現(xiàn)了類限制性酶并闡明其性質(zhì)。 1971 Nathans等首次制作酶切圖譜。 因他們發(fā)現(xiàn)了限制性酶并應(yīng)用于分子遺傳學(xué)而獲1978年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第5頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四1962 , Arber, 1968 Smith等發(fā)現(xiàn)限制性酶 W. Arber (1929 ) H. O.

3、Smith (1931 ) Biozentrum der Universitt Basel, Johns Hopkins University School Switzerland of Medicine,USA 第6頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四寄主控制的限制與修飾作用：第7頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四感染過A菌的噬菌體進(jìn)入B幾乎總是被切成小片斷的現(xiàn)象，稱限制。寄主使它再次感染時(shí)能夠有效生長而沒有收到限制的現(xiàn)象，稱修飾。 第8頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四二.限制性內(nèi)切酶的類型（P44）基因工程中最常用的是型酶第

4、9頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四二. 型酶的命名,書寫與剪切方式：限制酶 來源 剪切方式Eco R I Escherichia coli RY 13 GAATTCPst I Providencia stuartii 164 CTGCAGBse Bacilus stearothermophilus strain 822(Hpa) GTTAACEcoR(E：屬名；co：種名；R：株；：發(fā)現(xiàn)次序)第10頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四Cla Nco Nde Not Sac Xba Xho 有些內(nèi)切酶來源于無菌株名的細(xì)菌第11頁，共73頁，2022年，

5、5月20日，5點(diǎn)54分，星期四型內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列中心對稱5 G A A T T C 33 C T T A A G 5EcoR 第12頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四酶切位點(diǎn)及酶切未端平未端5 G A T A T C 33 C T A T A G 5EcoR 5 G A T A T C 33 C T A T A G 5第13頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四EcoR (5 GAT ATC 3)Hinc (5 GT(T/C) (A/G)AC 3)Hind (5 GT(T/C) (A/G)AC 3)Sca (5 AGT ACT 3)Sma (5 CCC

6、 GGG 3)第14頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四具5突出未端的粘性未端5 G A A T T C 33 C T T A A G 55 G 3 5 A A T T C 33 C T T A A 5 3 G 5EcoR 第15頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四BamH (5 G GATCC 3)EcoR (5 G AATTC 3)Hind (5 A AGCTT 3)Nco (5 C CATGG 3)Nde (5 CA TATG 3)Not (5 GC GGCCGC 3)Sal (5 G TCGAC 3)Xba (5 T CTAGA 3)Xho (5

7、 C TCGAG 3)第16頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四具3突出未端的粘性未端5 G A G C T C 33 C T C G A G 55 G A G C T 3 5 C 33 C 5 3 T C G A G 5Sac 第17頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四Kpn (5 GGTAC C 3)Pst (5 CTGCA G 3)Sac (5 GAGCT C 3)第18頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四識別同一序列且在同一位置(有時(shí)不)切割DNA的內(nèi)切酶稱為同裂酶Hinc (5 GT(T/C) (A/G)AC 3) Hind

8、 (5 GT(T/C) (A/G)AC 3)Sma (5 CCC GGG 3) Xma (5 C CCGGG 3)同裂酶第19頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四來源和識別都不同，但酶切產(chǎn)生相同末端的內(nèi)切酶稱為同尾酶專指產(chǎn)生粘性未端的內(nèi)切酶同尾酶第20頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四5 G G A T C C 33 C C T A G G 5BamH 5 G 33 C C T A G 55 A G A T C T 33 T C T A G A 5Bgl 5 G A T C T 3 3 A 5T4 DNA Ligase5 G 3 C C T A G G

9、 A T C T 3 A 5 連接處不再是內(nèi)切酶識別序列第21頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四 BamH / Bgl Sal / Xho Spe / Xba 第22頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四三、限制酶的識別序列與DNA的切割（P47）1、限制酶的識別序列與DNA的來源無關(guān)，不具有種的特異性；2、限制酶識別序列的長短涉及對DNA分子切割的頻率，可以從理論上推導(dǎo)酶切DNA片段的大??；作用于同一種DNA分子，識別序列短的出現(xiàn)概率大，酶切DNA片段小。識別位點(diǎn)： 4個(gè)堿基：44 = 256 6個(gè)堿基：46 = 4096 第23頁，共73頁，2022

10、年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四3、限制酶識別序列的相鄰序列效應(yīng)（P48）：即大多數(shù)限制性內(nèi)切酶對只含識別序列的寡核苷酸沒有催化活性，需在兩側(cè)各延長一個(gè)或幾個(gè)核苷酸才能被有效酶切。 應(yīng)用：設(shè)計(jì)引物時(shí)加保護(hù)堿基。第24頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四4、限制酶的位點(diǎn)偏愛性(p48):限制性核酸酶的切割效率與酶切位點(diǎn)側(cè)翼序列的核苷酸組成有關(guān)。這是一些限制性內(nèi)切酶酶切效率不高的原因。例如：在實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)HindIII、XbaI等酶活性較低。應(yīng)用：涉及局部消化時(shí)應(yīng)考慮使用這些酶。例如，構(gòu)建基因組文庫時(shí)，需要對基因組DNA進(jìn)行不完全酶切。第25頁，共73頁，2022年

11、，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四5、星活性(P48)正常條件下EcoR 識別5-GAATTC-3, 當(dāng)處于低鹽(8.0)或高甘油(50%)時(shí)識別5-AATT-3；星活性是指某些限制性核酸內(nèi)切酶在不適的環(huán)境中其識別序列發(fā)生改變的現(xiàn)象。第26頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四四. 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素(P49)1 底物DNA的純度在DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切酶的活性。 第27頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四解決辦法：A. 增加

12、限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些。B擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋。C延長酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。第28頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四2 底物DNA的甲基化程度解決辦法：更換缺失了甲基化酶的菌株 選擇同裂酶第29頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四3 酶切消化反應(yīng)的溫度一般內(nèi)切酶的反應(yīng)溫度為37特例：Sma I: 25 Taq I: 65 Mae I: 45第30頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四4 酶切緩沖液成分：MgCl2、Tris-HCl、-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）以及

13、牛血清蛋白（BSA） 酶活性的正常發(fā)揮，是絕對地需要二價(jià)的陽離子，通常是Mg2+。Tris-HCl的作用，在于使反應(yīng)混合物的PH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。疏基試劑對于保持某些限制酶的穩(wěn)定性可能是有用的，但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。有一部分限制酶對于鈉離子或鉀離子濃度變化反應(yīng)十分敏感，而一部分限制酶則可適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度變化幅度。 操作中注意事項(xiàng)：合適的溫度；內(nèi)切酶的用量不超酶切總體積的1/10第31頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四酶切反應(yīng)酶 (多數(shù)已商品化, 以10u/l溶液形式提供)反應(yīng)緩沖液 (以5倍或10倍母液隨酶提供)反應(yīng)時(shí)間: 隨D

14、NA及酶用量而定, 一般數(shù)小時(shí)至過夜第32頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第二節(jié)DNA連接酶 第33頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四核酸酶是“剪刀”連接酶就是“漿糊”、“膠水”第34頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四一.連接酶 (DNA ligase) 在E.coli和動植物細(xì)胞中都有此酶。能催化DNA 中相鄰的3-OH和5-P之間形成磷酸二脂鍵。(P51) 第35頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四連接酶的功能：(1)能封閉DNA雙鏈或RNA/DNA雜種雙鏈中的單鏈缺口，而不能封閉雙鏈RNA中的單鏈缺口

15、(2)能封閉粘性末端退火后出現(xiàn)的缺口；DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口（nick）,而不能封閉裂口（gap）。 用途：(1)通過粘端連接DNA分子；(2)連接平端雙鏈DNA分子或平端DNA與人工接頭的連接。第36頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四基因工程的操作過程切接轉(zhuǎn)增檢第37頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) 1967年，世界上有數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶(1igase)。 這種酶需要在一條DNA鏈的3，末端具有一個(gè)游離的羥基(OH)，和在另一條DNA鏈的5

16、，末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(P)，只有在這種情況下，才能發(fā)揮其連接DNA分子的功能作用 第38頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四在大腸桿菌及其它細(xì)菌中，DNA連接酶催化的連接反應(yīng)，是利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在動物細(xì)胞及噬菌體中，則是利用ATP腺苷三磷酸作能源。 DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的鏈必須是雙螺旋的一部分。實(shí)際上，DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。第39頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分

17、，星期四第40頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第41頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四分類： 用于共價(jià)連接DNA限制片段的連接酶有兩種不同的來源：一種是由大腸桿菌染色體編碼的叫做DNA連接酶。 另一種是由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼的叫做T4DNA連接酶。 這兩種DNA連接酶，除了前者用NAD+作能源輔助因子，后者用ATP作能源輔助因子外，其它的作用機(jī)理并沒有什么差別。 第42頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四 連接酶連接缺口DNA的最佳反應(yīng)溫度是37。但是在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此，連接粘性末端的最

18、佳溫度，應(yīng)是界于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般認(rèn)為6比較合適 第43頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四粘性末端DNA片段的連接 3.1 粘性末端的連接 DNA連接酶最突出的特點(diǎn)是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。應(yīng)用DNA連接酶這種特性，可在體外將具有粘性末端的DNA限制片段，插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，從而可以按照人們的意圖構(gòu)建出新的DNA雜種分子。具粘性末端的DNA片段的連接比較容易，也比較常用。 第44頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第45頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四3.2 平

19、末端DNA片段的連接 不具有粘性末端的DNA分子也可以被連接起來。連接這種平末端DNA分子的方法有4種， （1）直接用T4DNA連接酶連接； （2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端DNA分子加 上同聚物尾巴之后再用DNA連接酶進(jìn)行連接； （3）用銜接物連接平末端DNA分子； （4）DNA接頭連接法。 第46頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四（1）直接用T4DNA連接酶連接 T4DNA連接酶除了能夠封閉具有3，一OH和5一P末端的雙鏈DNA的缺口之外，在存在ATP和加入高濃度酶的條件下，它還能夠連接具有完全堿基配對的平末端的DNA分子。這種反應(yīng)的原因目前尚不清楚。但平末端連接

20、效率不高。 第47頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四（2）同聚物加尾連接平末端DNA片段 運(yùn)用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，能夠?qū)⒑塑账?通過脫氧核苷三磷酸前體)，加到DNA分子單鏈延伸末端的3，一OH基團(tuán)上，它并不需要模板鏈的存在，它一個(gè)一個(gè)加上核苷酸，構(gòu)成由核苷酸組成的尾巴，長度可達(dá)100個(gè)核苷酸。 第48頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四(3) 用銜接物連接平末端DNA分子 如果重組體DNA是用T4DNA連接酶的平末端連接或是用同聚物加尾構(gòu)建的，那么就無法用原來的限制酶作特異的切割，因此也不能獲得插入DNA片段。為了解決這個(gè)問題，可采用銜接物法提供必要的序

21、列，進(jìn)行DNA分子的連接。 所謂銜接物(1inker) ，是指用化學(xué)方法合成的一段由1012個(gè)核苷酸組成的、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。 第49頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四（4）DNA接頭連接法 DNA銜接物連接法盡管有諸多方面的優(yōu)越性，但也有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的銜接物相同的限制位點(diǎn)，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也就會把克隆基因切成不同的片段，從而為后繼的亞克隆及其它操作造成麻煩。 當(dāng)然，在遇到這種情況時(shí)，一個(gè)方法可改用其它類型的銜接物，另一種公認(rèn)的較好的替代辦法是改用DNA接頭(ada

22、pter)連接法。 第50頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四DNA接頭(adapter)連接法于1978年由康乃爾大學(xué)吳瑞教授發(fā)明的。它是一類由人工合成的一頭具有某種限制性內(nèi)切酶粘末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸片段。當(dāng)它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之后，便會使后者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易于連接重組。 第51頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第52頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第三節(jié).DNA聚合酶類DNA聚合酶：催化以DNA為模板合成DNA的反應(yīng).特點(diǎn): (1)以dNTPs作底物；(2)有模板存在

23、；(3)有引物存在；(4)新鏈合成方向?yàn)?3第53頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第54頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四 一分子的核苷酸的3-位羥基與另一分子核苷酸的5-位磷酸基通過脫水可形成3,5-磷酸二酯鍵，從而將兩分子核苷酸連接起來。 第55頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四多核苷酸鏈：核酸就是由許多核苷酸單位通過3,5-磷酸二酯鍵連接起來形成的不含側(cè)鏈的長鏈狀化合物。核酸具有方向性的長鏈狀化合物，多核苷酸鏈的兩端，一端稱為5-端，另一端稱為3-端。第56頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四1、DN

24、A聚合酶I(DNA polymerase I )DNA pol I 單鏈多肽，MW109kD,可被枯草桿菌蛋白酶切成兩段：C-端大片斷(Klenow 酶)，MW67kD,具53聚合酶和3 5外切酶活性N-端小片斷MW35kD,具53外切酶活性。 (一)聚合酶活性： Mg2+ DNA ndNTPs DNA(pdN)n+nPPi 5 CCGOH Mg2+ 5 CCGATACC 3GGCTATGG 3GGCTATGG條件：dNTPs和Mg2+；DNA模板；引物鏈第57頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四(二)外切酶活性(2) 53外切酶活性: 切補(bǔ)作用 從游離的5端降解DNA，對

25、DNA雙鏈部分的磷酸二脂鍵有切除功能，每次切10nt 5 CGCATCT Mg2+ 5 CATCT 3GCGCGTAGA 3GCGCGTAGA(3) 3 5外切酶活性: 校對作用從游離的5端降解dsDNA和ssDNA 5CGCATCT Mg2+ 5CGC 3GCG 3GCG第58頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四核酸外切酶活性35外切酶活性53外切酶活性第59頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四2、 Klenow聚合酶 5-3端的外切酶活性 5-3端的聚合酶活性3、 T4 DNA聚合酶 來源于被T4噬菌體感染的大腸桿菌，作用同上4、 T7 DNA聚合酶

26、 來源于被T7噬菌體感染的大腸桿菌，作用同上5、 Taq DNA聚合酶 耐高溫第60頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四 6.逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 以RNA為模板的DNA聚合酶，來源于鼠（MLV）和禽類（AMV）的反轉(zhuǎn)錄病毒。由兩條肽鏈組成，具有53聚合酶和RNaseH活性(見P55）。用途：(1)以RNA為模板合成cDNA,作為插入載體的目的基因或構(gòu)建cDNA 文庫；(2)建立反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR)(3)以ssDNA或RNA為模板合成雜交探針。第61頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 1)

27、特點(diǎn)： 依賴于RNA的DNA聚合酶活性； 依賴于DNA的DNA聚合酶活性； 不具內(nèi)切酶活性; RNase H活性低; 2) 與AMV反轉(zhuǎn)錄酶比較 a合成短鏈cDNA(0.6 kb)時(shí)，兩者相同，但M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶需要量大，可能與其穩(wěn)定性差有關(guān) b合成長鏈cDNA(4.5-7.5 kb)時(shí)，它比AMV反轉(zhuǎn)錄酶有效得多，這與它無內(nèi)切酶活性有關(guān)。 3) 用途 a. cDNA合成用于文庫建立; b. 制備cDNA探針; c. DNA序列分析; d. 填補(bǔ)5-突起末端以獲平端AMV反轉(zhuǎn)錄酶能夠從DNA-RNA的雜交鏈中特異性地降解RNA鏈，進(jìn)而保留新合成的DNA鏈。具有RNaseH活性第62頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第63頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四第四節(jié)、修飾酶類1、末端轉(zhuǎn)移酶2、堿性磷酸酶3、S1核酸酶4、T4多核苷酸激酶第64頁，共73頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)54分，星期四末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 取自小牛胸腺,催