分子熒光分析法課件

1、化學(xué)分析（）第十一章 熒光分析法1化學(xué)分析（）第十一章 熒光分析法1基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜的特征，分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系；影響熒光強度的因素，熒光定量分析方法。熟悉分子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)的各種途徑，熒光壽命與熒光效率。了解熒光分光光度計與其他熒光分析技術(shù)。2基本要求掌握分子熒光的發(fā)生過程，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，熒光光譜 處于基態(tài)的分子吸收能量被激發(fā)至激發(fā)態(tài)，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)釋放能量返回至基態(tài)。如果通過碰撞以熱能或動能的形式釋放能量回到基態(tài)，稱為無輻射躍遷；如果是以輻射(發(fā)射光子)的形式回到基態(tài)，此種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光包括熒光和磷光。概 念3 處

2、于基態(tài)的分子吸收能量被激發(fā)至激發(fā)態(tài)熒光分析法 定義：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。待測物質(zhì)分子熒光原子熒光激發(fā)光的波長范圍紫外-可見熒光紅外熒光X射線熒光 分類：4熒光分析法 定義：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)熒光分析法的特點 靈敏度高：檢測限0.0001 g/mL, 比分光光度法高24個數(shù)量級。（在黑背景下檢測；光源的強度大） 選擇性高：適當(dāng)選擇激發(fā)光的波長和熒光測定的波長；應(yīng)用熒光壽命的差別 時間分辨技術(shù)。5熒光分析法的特點 靈敏度高：檢測限0.0001 g/mMFS與UV/Vis 法比較： 原理UV/Vis 吸收MFS 發(fā)射測定方法I0ItF靈敏度

3、, 選擇性10-510-6molL-110-710-9 molL-1I0F6MFS與UV/Vis 法比較： 1575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。1852年，Sir George Stokes對熒光產(chǎn)生的機理作了解釋，并提出了“熒光”。1867年，首次用于分析測定。1928年，Jette和West提出第一臺光電熒光計。1952年，商品熒光分光光度計出現(xiàn)。71575年，西班牙醫(yī)生N.Monardes發(fā)現(xiàn)。7第一節(jié) 熒光分析法的基本原理一、分子熒光二、熒光與分子結(jié)構(gòu)三、影響熒光強度的外部因素8第一節(jié) 熒光分析法的基本原理一、分子熒光二、熒光與分子結(jié)一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子

4、的電子能級與激發(fā)過程分子的多重性M:M=2s+1，s表示總自旋量子數(shù)，s=0時分子所處的電子能態(tài)為單重態(tài)，用S來表示；s=1時分子所處的電子能態(tài)為三重態(tài)，用T來表示；9一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級與激發(fā)過程光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷光振動馳豫內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨躍2. 熒光的產(chǎn)生10光吸收過程失活過程發(fā)光失活分子間能量轉(zhuǎn)移失活非輻射失活熒光磷吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫系間跨躍振動馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:109107 s磷光壽命:10410 s圖11-2 熒光和磷光產(chǎn)生示意圖11吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳

5、豫系間跨躍振動馳輻射躍遷發(fā)光失活熒光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)單線態(tài)S1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。磷光：激發(fā)態(tài)分子從第一激發(fā)三重態(tài)T1的最低振動能級回到基態(tài)S0所發(fā)出的輻射。波長關(guān)系：激發(fā)光熒光磷光。 12輻射躍遷發(fā)光失活12無輻射失活a.振動弛豫：激發(fā)態(tài)分子由同一電子能級中的較高振動能級轉(zhuǎn)至較低振動能級的過程，其效率較高b.內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)兩個電子能級非常接近以致其振動能級有重疊時，電子由高能級回到低能級的過程。13無輻射失活13無輻射失活c.外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑、溶質(zhì)分子之間發(fā)生相互碰撞而失去能量的過程。d.系間跨越：激發(fā)態(tài)分子的電子自旋發(fā)生倒轉(zhuǎn)而使分子的多重態(tài)發(fā)生變化的過程。14

6、無輻射失活14吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫系間跨躍振動馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:109107 s磷光壽命:10410 s圖11-2 熒光和磷光產(chǎn)生示意圖15吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫系間跨躍振動馳結(jié)論：熒光是來自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過程的速率常數(shù)大，激發(fā)壽命短；磷光是來自最低激發(fā)三重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光過程的速率常數(shù)小，激發(fā)壽命相對比較長。16結(jié)論：熒光是來自最低激發(fā)單重態(tài)的輻射躍遷過程所伴隨的發(fā)光現(xiàn)象復(fù)習(xí)：熒光的產(chǎn)生基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？17復(fù)習(xí)：基態(tài)分子hv激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，如何回去？17S2

7、S0S1T1l2l1分子的吸收情況18S2S0S1T1l2l1分子的吸收情況18S2S0S1T1l2l1振動弛豫：在同一電子能級（激發(fā)態(tài)）特點：無輻射；速率快 （10-1410-12 s內(nèi)完成）19S2S0S1T1l2l1振動弛豫：在同一電子能級（激發(fā)態(tài)）S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internal conversion) ：相同多重性的兩個電子能級之間的非輻射躍遷20S2S0S1T1l2l1內(nèi)轉(zhuǎn)移（internal conveS2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescence21S2S0S1T1l2l1l3熒光發(fā)射Fluorescencel1l2l3l3 l1 l2 Only

8、l322l1l2l3l3 l1 l2 22S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4Intersystem CrossingPhosphorescence23S2S0S1T1l2l1系間跨躍磷光發(fā)射l4IntersysS0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移 External Conversion24S0S1T1l2l1外轉(zhuǎn)移 External Convers復(fù)習(xí) 分子熒光的發(fā)生過程基態(tài)分子 概念：基態(tài)、激發(fā)態(tài)（激發(fā)單重態(tài)S*、激發(fā)三重態(tài)T*） 能量傳遞過程：1、無輻射躍遷（振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、外轉(zhuǎn)換、系間跨越）2、輻射躍遷（熒光、磷光）25復(fù)習(xí) 分子熒光的發(fā)生過程25吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換

9、振動馳豫系間跨躍振動馳豫外轉(zhuǎn)換基態(tài)熒光壽命:109107 s磷光壽命:10410 s圖11-2 熒光和磷光產(chǎn)生示意圖26吸收熒光磷光激發(fā)單重態(tài)激發(fā)三重態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動馳豫系間跨躍振動馳（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。激發(fā)光譜：不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。熒光光譜：在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對強度。圖11-3 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜27（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)分子都具有兩個特征光譜激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個特點： 斯托克斯位移，波長：熒光激發(fā)光；熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)光波長無關(guān)；熒光光譜和激

10、發(fā)光譜大致成鏡像關(guān)系。圖11-3 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜28激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有三個特點：圖11-3 蒽的激發(fā)光譜和蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:Excitation Spectrum, 激發(fā)波長:ex發(fā)射光譜 Emission Spectrum, 發(fā)射波長:em圖11-3 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜b0b1b2b3c3c2c1c029蒽的激發(fā)光譜(吸收光譜)和發(fā)射光譜(熒光光譜)激發(fā)光譜:Ex二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(f)： 除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到激發(fā)時最大熒光強度的 1/e 所需的時間稱為熒光壽命(10-810-10s)。熒光

11、物質(zhì)受到一個極短時間的脈沖光激發(fā)后，熒光強度從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化，可用指數(shù)衰減定律表示 Ft = F0 e-Kt，推導(dǎo)得 ln F0/Ft = t /f F0、Ft ：開始時和t時的熒光強度， K為衰減常數(shù)。30二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命(f)：熒光效率(f)：又稱為熒光量子產(chǎn)率 或熒光產(chǎn)率。3131（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng) * 躍遷 芳香族化合物、五元雜環(huán)上取代苯基. 共軛體系越大,越易產(chǎn)生熒光,熒光效率也增大.(CH=CH)3 =0.68(CH=CH)2=0.2832（二）有機化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系1.共軛效應(yīng) 2. 剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)

12、酚酞(無熒光)8羥基喹啉(弱熒光)紅色熒光CO-OOCOO-COCOO-ONO-NOMgNO熒光黃332. 剛性結(jié)構(gòu)和共平面效應(yīng)酚酞(無熒光)8羥基喹啉(弱熒光聯(lián)二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 強熒光物質(zhì))CH234聯(lián)二苯 = 0.2芴 = 1.03,4-苯并芘( 強Ff0.75Ff0.03扭轉(zhuǎn)離開了平面構(gòu)型，影響了p-p共軛作用35Ff0.75Ff0.03扭轉(zhuǎn)離開了平面構(gòu)型，影響了p-p順式二苯乙烯無熒光反式二苯乙烯強熒光36順式二苯乙烯反式二苯乙烯363. 取代基的作用 給電子基增強熒光： OH,OR,NH2,NHR,NR2,CN吸電子基減弱熒光： COOH,C=O,NO2

13、,NN,Cl,Br,I 與體系作用小的取代基影響不明顯： SO3R,NH3,SH,F,R。COOHNO2I無熒光NH2OH比熒光強50倍373. 取代基的作用 給電子基增強熒光：COOHNO 取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和剛性會加強熒光:堿性有熒光COOHOH無熒光OHCOOH水楊酸中性、堿性均有熒光OHOHCO38 取代基之間若發(fā)生氫鍵，增強分子平面性和（三）熒光試劑熒光胺鄰苯二甲醛（OPA）1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘 （Dansyl-Cl，丹酰氯）測定無機離子的熒光試劑39（三）熒光試劑熒光胺39有機化合物的熒光分析(1)熒光胺(2)鄰苯二甲醛(3)丹酰氯熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒

14、光熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺類形成的衍生物有高強度熒光40有機化合物的熒光分析熒光胺及其水解熒光胺與脂肪族或芳香族伯胺NOHHOOHN=NHOSO3Na8羥基喹啉(Al,Be等)茜素紫醬R(Al,F-等)用于測定無機離子的有機試劑CCOOHH安息香(B,Zn,Ge,Si等)黃酮醇(Zr,Sn等)OOHO41NOHHOOHN=NHOSO3Na8羥基喹啉(Al,Be等三、影響熒光強度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響外部因素：外界條件對熒光效率的影響42三、影響熒光強度的主要因素內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強的紫外吸收和一定的熒光產(chǎn)率是

15、發(fā)射熒光的兩個必備條件。分子結(jié)構(gòu)中有躍遷（K帶強吸收）或n躍遷（R帶弱吸收）。 長共軛結(jié)構(gòu)：分子中必須具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)。共軛度越大，發(fā)射波長長移，發(fā)光強度增加。 分子的剛性和共平面性：具有剛性平面性結(jié)構(gòu)的分子熒光量子產(chǎn)率高。 取代基的影響：給電子取代基使熒光強度增大；而吸電子取代基則使熒光強度降低。 1.內(nèi)部因素43內(nèi)部因素：分子結(jié)構(gòu)對熒光效率的影響。物質(zhì)分子有強的紫外吸收和長共軛結(jié)構(gòu)示例苯205/278/0.11萘286/321/0.29蒽356/404/0.36維生素A ex327nm；em510nm 44長共軛結(jié)構(gòu)示例苯萘蒽維生素A ex327nm；em5剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物

16、后，如果分子的剛性和共平面性增強，可使熒光增強。聯(lián)苯f0.2 芴f1.08-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂 45剛性和共平面結(jié)構(gòu)示例形成絡(luò)合物后，如果分子的剛性和共平面性增空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順反異構(gòu)體：反式分子有熒光，而順式分子沒有熒光(位阻原因)。例如：1，2二苯乙烯反式有強烈熒光，而順式無熒光。1-二甲胺基萘-7-磺酸鹽 1-二甲胺基萘-8-磺酸鹽 f0.75 f0.0346空間位阻使分子共平面性下降，熒光減弱。順反異構(gòu)體：反式分子有取代基作用第一類取代基是給電子基團，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高，熒光波長長移。如：NH2、OH、OCH3 、NHR、CN等。第二類取

17、代基是吸電子基團，會妨礙分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。如：COOH、NO2、CO、NO、SH、NHCOCH3、X(鹵素原子序數(shù)，熒光效率)等。第三類取代基對電子共軛體系作用較小，對熒光的影響不明顯。如：R、SO3H、NH3等。 47取代基作用47表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式F/nm相對熒光強度苯C6H6270-31010甲苯C6H5CH3270-32017丙基苯C6H5C3H7270-32017氟代苯C6H5F270-32010氯代苯C6H5Cl275-3457溴代苯C6H5Br290-3805碘代苯C6H5I-0苯酚C6H5OH285-36518苯酚陰離子C6H5O-310

18、-40010甲氧基苯C6H5OCH3285-34520苯胺C6H5NH2310-40520苯胺正離子C6H5NH3+-0苯甲酸C6H5COOH310-3903腈基苯C6H5CN280-36020硝基苯C6H5NO2-048表苯環(huán)上取代基對熒光的影響化合物分子式F/nm相對熒光強外部因素：外界條件對熒光強度的影響 溫度的影響：溫度降低會使熒光強度增大；溫度升高熒光強度減小。溶劑的影響：溶劑極性增加有時會使熒光強度增加，熒光波長長移；溶劑的黏度減小，熒光強度減弱。pH的影響：對于弱酸或弱堿性熒光物質(zhì)，溶液的pH值改變，影響其解離平衡，使熒光強度發(fā)生變化。熒光熄滅的影響：熒光物質(zhì)與熒光熄滅劑相互作用

19、，引起熒光強度降低。 散射光的干擾：瑞利光和拉曼光。2.外部因素49外部因素：外界條件對熒光強度的影響2.外部因素49溫度：T 低，f增加。 熒光素鈉的乙醇溶液, T0時,每降低10, 增加3%, -80 時=100% . 50溫度：T 低，f增加。50溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強，熒光強度增大，熒光波長紅移。溶劑相對介電常數(shù)熒光峰l/nm熒光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002巰基喹啉在不同溶劑中的熒光峰和熒光效率51溶劑的極性：電子激發(fā)態(tài)比基態(tài)的極性大，溶劑的極性增強，熒光強pH值影響

20、熒光強度示例 pH值： 13存在形式：離子 分子 離子有無熒光：無 藍色熒光 無52pH值影響熒光強度示例 pH值： 2 熄滅劑： 鹵素離子、重金屬離子、溶解氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。瑞利光(Reyleigh scattering light)： 光子與分子發(fā)生彈性碰撞時，僅改變光子運動方向，不發(fā)生能量交換，這種散射光稱為瑞利光。 特點：波長與入射光相同。53熄滅劑：53拉曼光(Raman scattering light)： 光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時，不僅改變光子運動方向，而且發(fā)生能量交換，這種散射光稱為拉曼光。特點： 當(dāng)光子失去部分能量時，波長比入射光長，干擾

21、最大； 當(dāng)光子多得到部分能量時，波長比入射光短。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長可消除拉曼光干擾。54拉曼光(Raman scattering light)：54例如：硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜55例如：硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜55320448448360320350400350激發(fā)350nm硫酸奎寧激發(fā)320nm硫酸奎寧激發(fā)350nm0.1mol/LH2SO4激發(fā)320nm0.1mol/LH2SO4強度(a)強度(b)/nm/nm/nm/nm圖11-6 硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光光譜和散射光譜56320448448360320350400350激發(fā)35

22、0n熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(F)與熒光物質(zhì)吸收光的程度以及發(fā)射熒光的能力有關(guān)。測試熒光的方向與激發(fā)光入射方向垂直，吸收池是四面透光的。熒光分析定量依據(jù)：熒光強度F與濃度c成線性關(guān)系。第二節(jié) 熒光定量分析方法57熒光是物質(zhì)吸收光子之后發(fā)出的光，熒光強度(F)與熒光物質(zhì)吸收Fc一般當(dāng)b c 0.05 時, F 與c呈線性關(guān)系 高濃度時，熒光物質(zhì)發(fā)生自熄滅和自吸收現(xiàn)象，使F與c不呈線性關(guān)系Fc58Fc一般當(dāng)b c 0.05 時, F 與c呈線性關(guān)系 二、定量分析方法1. 校正曲線法2. 比例法3. 聯(lián)立方程式法59二、定量分析方法1. 校正曲線法591、標(biāo)準(zhǔn)曲線法1）確定ex和em

23、 (激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)；2）確定適宜的條件: 試劑濃度、pH、T、t 等；3）以標(biāo)準(zhǔn)溶液做工作曲線；4）測未知樣的熒光強度(F), 根據(jù)工作曲線計算熒光物質(zhì)的濃度.601、標(biāo)準(zhǔn)曲線法1）確定ex和em (激發(fā)光譜和發(fā)射光譜)2、比例法：若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點，在線性范圍內(nèi)可采用比例法(只需1個標(biāo)準(zhǔn)溶液)；若標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點，則應(yīng)扣除空白溶液的熒光強度后再計算：3、聯(lián)立方程式法：多組分混合物的熒光分析6161第三節(jié) 熒光分光光度計及其他熒光分析技術(shù)I0ItF氙燈(或高壓汞燈）（200-800 nm)光電倍增管圖11-7 熒光分光光度計示意圖62第三節(jié) 熒光分光光度計及其他熒光分析技術(shù)I0ItF氙燈(或熒光儀部件激發(fā)光源: 能夠在紫外-可見光區(qū)連續(xù)發(fā)光， 常用氙燈、高壓汞燈或激光光源.樣品池: 石英池, 四壁透明.單色器: 兩個光柵單色器, 分置于樣品池前后.檢測器: 光電池或光電倍增管, 與激發(fā)光成直角的 方向檢測熒光.63熒光儀部件激發(fā)光源: 能夠在紫外-可見光區(qū)連續(xù)發(fā)光，63熒光光度計光路圖電源光度計記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光柵反射鏡反射鏡激發(fā)單色器發(fā)射單色器64熒光光度計光路圖電源光度計記錄儀光電倍增管試樣液池光源光柵光儀器的校正靈敏度校正波長校正激發(fā)光譜和熒光光譜校正65儀器的校正靈敏度校正65二、其他熒光分析技術(shù)簡介（自學(xué)）激光分析技術(shù)