細胞工程學醫(yī)學知識培訓課件

1、細胞工程學醫(yī)學知識細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)技術是生命科學中常用的研究手段，動物細胞與組織培養(yǎng)是從動物體內取出細胞或組織，模擬體內的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使細胞或組織在體外生存、生長并維持結構和功能的一門技術。 2細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)技術是生命科學中常用的研究手段，動物細胞與組 細胞培養(yǎng)( Cell culture )：指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬機體的生理環(huán)境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，并維持其結構和功能的一種培養(yǎng)技術。3細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)( Cell culture )：指的是在無 活細胞是構成活的有機體的基本單位。

2、 生、老、病、死、優(yōu)生、抗衰老、防治各種疾病的途徑、人為地誘導和改變細胞的遺傳性狀和特性，等等均與活細胞的研究密切相關。4細胞工程學醫(yī)學知識 活細胞是構成活的有機體的基本單位。4細胞工程學醫(yī)學知第一節(jié) 細胞培養(yǎng)研究的發(fā)展簡史5細胞工程學醫(yī)學知識第一節(jié) 5細胞工程學醫(yī)學知識1665年：Robert Hooke（英） 用自己制造的顯微鏡觀察軟木片，發(fā)現有許多小孔，狀如蜂窩，他便稱之為細胞（cell）。這是細胞的發(fā)現。1838年: M.J.Schleiden（德） 植物學家施萊登提出：細胞是一切植物的基本構造；細胞不僅本身是獨立的生命，并且是植物體生命的一部分，并維系著整個植物體的生命。6細胞工程學

3、醫(yī)學知識1665年：Robert Hooke（英）6細胞工程學醫(yī)學知1839年：T.A.H.Schwann（德） 動物學家施旺受到施萊登的啟發(fā)，結合自身的動物細胞研究成果，把細胞說擴大到動物界，提出一切動物組織均由細胞組成，從而建立了生物學中統(tǒng)一的細胞學說。 7細胞工程學醫(yī)學知識1839年：T.A.H.Schwann（德）7細胞工程學醫(yī)學1859年：Vupian(法) 蛙尾部組織切下放入普通水中進行“培養(yǎng)”，觀察到生長和分化現象。1885年：Roux(德) 把雞胚的神經板在溫熱的生理鹽水中維持其存活數天，這是有記錄的第一個體外移植成功的例子，也是首次體外培養(yǎng)的嘗試 。8細胞工程學醫(yī)學知識185

4、9年：Vupian(法) 8細胞工程學醫(yī)學知識 1897年：B .Loeb 首次在含有少量血漿凝塊的試管中培養(yǎng)成年兔的肝、腎、甲狀腺和卵巢植塊，植塊在3天內仍能保持正常的組織學結構。這是器官培養(yǎng)的最早嘗試。9細胞工程學醫(yī)學知識 1897年：B .Loeb9細胞工程學醫(yī)學知識1906年：SP Beele J Ewing 蓋片懸滴法用動物血清使狗的淋巴肉瘤細胞在體外存活了72小時。 體外培養(yǎng)技術的開端。問題：血漿與血清的區(qū)別？10細胞工程學醫(yī)學知識1906年：SP Beele J Ewing10細胞工程學 血漿是離開血管的全血經抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細胞成分的液體，其中含有纖維蛋白

5、原（纖維蛋白原能轉換成纖維蛋白，具有凝血作用），若向血漿中加入Ca2+ ，血漿會發(fā)生再凝固，因此血漿中不含游離的Ca2+。血漿和血清的區(qū)別 11細胞工程學醫(yī)學知識 血漿是離開血管的全血經抗凝處理后，通過離心沉淀， 血清是離體的血液凝固之后，經血凝塊聚縮釋出的液體，其中已無纖維蛋白原，但含有游離的 Ca2+，若向其中再加入 Ca2+，血清也不會再凝固。 血清中少了很多的凝血因子，但多了很多的凝血產物。另外，血清中含有特異性免疫體(如抗毒素或凝集素)的免疫血清(抗菌素血清)。 12細胞工程學醫(yī)學知識 血清是離體的血液凝固之后，經血凝塊聚縮釋出的液體1907年：R Harrison A Carrel

6、 將蛙胚髓管部的小片接種于蛙的淋巴液中，并用蓋片懸滴法培養(yǎng)細胞，有神經突起從培養(yǎng)的神經組織塊長出。第一次較為系統(tǒng)的觀察了體外培養(yǎng)活體組織的結果。 真正創(chuàng)立體外培養(yǎng)技術。13細胞工程學醫(yī)學知識1907年：R Harrison A Carrel13細胞1907年的實驗標志著： 體外培養(yǎng)技術創(chuàng)立； 蓋玻片懸滴法的建立； 神經組織體外培養(yǎng)的開始； 神經突起是由神經細胞長出的重大理論誕生。14細胞工程學醫(yī)學知識1907年的實驗標志著：14細胞工程學醫(yī)學知識法國科學家A.Carrel的實驗貢獻: 第一次將無菌操作概念引入體外培養(yǎng)實驗中。 創(chuàng)立培養(yǎng)組織包埋技術、營養(yǎng)供應以及傳代培養(yǎng)等許多條件和方法并引入蓋玻

7、片懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)。15細胞工程學醫(yī)學知識法國科學家A.Carrel的實驗貢獻:15細胞工程學醫(yī)學知識作為他技術才華的標志： 他在完全沒有抗生素的條件下，從一個雞胚心臟組織開始，將不斷進行細胞傳代，竟使雞胚心臟的細胞維持生存了34年，先后傳代3400次，令人信服地證明動物細胞有可能在體外無限地生長。16細胞工程學醫(yī)學知識作為他技術才華的標志：16細胞工程學醫(yī)學知識 1911年：M R Lewis 和W H Lewis兄弟對體外細胞生存所必需的條件進行了研究初步探索，研究了NaCl、CaCl、KCl、NaHCO3等生理鹽溶液成分與培養(yǎng)物生長的關系。17細胞工程學醫(yī)學知識 1911年：M R Lewi

8、s 和W H Lewis兄弟對1913年：Steinhand 體外培養(yǎng)痘苗病毒，為病毒學應用奠定基礎。 1915年：Goldschmidt 無脊椎動物組織的體外培養(yǎng)，成功的培養(yǎng)了鱗翅目昆蟲組織。18細胞工程學醫(yī)學知識1913年：Steinhand 18細胞工程學醫(yī)學知識1925年：Maximow 雙蓋片懸滴培養(yǎng)法。1926年： Carrely 卡氏瓶培養(yǎng)法，開創(chuàng)玻璃瓶培養(yǎng)方法。1926年：Strangeways 試管培養(yǎng)法。19細胞工程學醫(yī)學知識19細胞工程學醫(yī)學知識1933年：Gel 旋轉管培養(yǎng)法，并以此建立了許多細胞系，如：Hela細胞系。1949年：Polge等 發(fā)現甘油保護儲存細胞功能

9、，解決冷凍細胞受損的問題。 20細胞工程學醫(yī)學知識1933年：Gel 20細胞工程學醫(yī)學知識1950年：Morgan等人提出的199人工培養(yǎng)基 配方。1951年：Shannon和Earle建立T瓶培養(yǎng)法。1951年：Poment改良和設計了結構簡單 且易于消毒的灌流小室，使得 體外培養(yǎng)的細胞能夠在不斷更 新的培養(yǎng)液中生長。1954年：Earle建立了懸浮培養(yǎng)法。21細胞工程學醫(yī)學知識1950年：Morgan等人提出的199人工培養(yǎng)基 21細胞1957年：Dullbecco等人開始采用胰蛋 白酶消化處理來分離細胞的方法以及應用液體培養(yǎng)基的方法，使得體外培養(yǎng)單層細胞成為可能。1959年：Lovel

10、ock發(fā)現了一種新的化學冷凍保護劑二甲亞砜，凍存細胞效果更好。22細胞工程學醫(yī)學知識1957年：Dullbecco等人開始采用胰蛋 白酶消化1967年：AL Van Wezel 創(chuàng)立了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，增加了細胞附著的表面,充分利用空間和營養(yǎng)液，大大提高細胞和產物的數量及質量,大大減少勞力和成本。1972年：RA Knazek等創(chuàng)立了中空纖維細胞培養(yǎng)技術，提高了空間利用效率，將二維空間擴展為三維空間，與體內毛細管效應更為接近。23細胞工程學醫(yī)學知識1967年：AL Van Wezel 創(chuàng)立了微載體培養(yǎng)系統(tǒng)，第二節(jié) 細胞培養(yǎng)室和儀器設備的準備24細胞工程學醫(yī)學知識第二節(jié) 24細胞工程學醫(yī)學知識 細

11、胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。 25細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術，要求工作環(huán)境和條件必須一、實驗室設計總體要求環(huán)境：清爽整齊、井然有序、明潔清靜、簡單高效。要求：無塵、無毒、無菌。布局：內外有別。門、窗、墻的合理布局。 26細胞工程學醫(yī)學知識一、實驗室設計總體要求環(huán)境：26細胞工程學醫(yī)學知識準備室：培養(yǎng)器皿的清洗、烘干、包裝、培養(yǎng)物品的消毒、培養(yǎng)用液的配制以及供應物品的儲藏。緩沖室：換取消毒服、帽、罩、鞋等。培養(yǎng)室：專用進行細胞培養(yǎng)和各種無菌操作的實驗室。 27細胞工程學醫(yī)學知識準備室：培養(yǎng)器皿的清洗、烘干、包裝、培

12、養(yǎng)物品的消毒、培養(yǎng)用液培 養(yǎng) 室門：用拉門減少揚塵，迷宮式分布。窗：最好無窗，避免直射，減少溫差變化。墻：光滑、不反光、不刺激。地：用瓷磚或水磨石鋪，既光潔又防滑。燈：熒光燈、紫外燈、煤氣燈或酒精燈。臺：超凈工作臺、操作臺。28細胞工程學醫(yī)學知識培 養(yǎng) 室28細胞工程學醫(yī)學知識29細胞工程學醫(yī)學知識29細胞工程學醫(yī)學知識二、細胞培養(yǎng)的儀器設備30細胞工程學醫(yī)學知識二、細胞培養(yǎng)的儀器設備30細胞工程學醫(yī)學知識1、 超凈工作臺31細胞工程學醫(yī)學知識1、 超凈工作臺31細胞工程學醫(yī)學知識32細胞工程學醫(yī)學知識32細胞工程學醫(yī)學知識2、培養(yǎng)設備（1）恒溫培養(yǎng)箱： 干熱式；隔水式。（2）CO2培養(yǎng)箱：

13、5%CO2，維持培養(yǎng)液pH穩(wěn)定 減緩培養(yǎng)液的酸化。33細胞工程學醫(yī)學知識2、培養(yǎng)設備（1）恒溫培養(yǎng)箱：33細胞工程學醫(yī)學知識3、消毒設備 （1）高壓蒸汽消毒鍋 （2）電熱干燥箱 （3）過濾除菌裝置 34細胞工程學醫(yī)學知識3、消毒設備 （1）高壓蒸汽消毒鍋 34細胞工程學醫(yī)學4、冰 箱（1）家用冰箱 （2）低溫冰箱 （3）冷藏柜 （4）冷凍柜 35細胞工程學醫(yī)學知識4、冰 箱（1）家用冰箱 35細胞工程學醫(yī)學知識5、水質純化裝置（1）重蒸水裝置（2）去離子水制備（3）逆向滲透凈水裝置 36細胞工程學醫(yī)學知識5、水質純化裝置（1）重蒸水裝置36細胞工程學醫(yī)學知識水質處理與制備重蒸水蒸餾器去離子水生

14、產機37細胞工程學醫(yī)學知識水質處理與制備重蒸水蒸餾器去離子水生產機37細胞工程學醫(yī)學知6、顯 微 鏡（1）倒置相差顯微鏡 （2）熒光顯微鏡 （3）紫外光顯微鏡 （4）普通光學顯微鏡38細胞工程學醫(yī)學知識6、顯 微 鏡（1）倒置相差顯微鏡 38細胞工程學醫(yī)學知識相差顯微鏡39細胞工程學醫(yī)學知識相差顯微鏡39細胞工程學醫(yī)學知識熒光顯微鏡40細胞工程學醫(yī)學知識熒光顯微鏡40細胞工程學醫(yī)學知識 用熒光染料對細胞中成分進行特異染色，由染料發(fā)出的熒光稱為染色熒光。 經化學反應使組織中非熒光物質轉變?yōu)闊晒馕镔|所發(fā)的熒光稱為誘發(fā)熒光。 41細胞工程學醫(yī)學知識 用熒光染料對細胞中成分進行特異染色，由染料發(fā)7、離

15、 心 機（1）臺式離心機 （2）冷凍高速離心機 42細胞工程學醫(yī)學知識7、離 心 機（1）臺式離心機 42細胞工程學醫(yī)學知識臺式離心機43細胞工程學醫(yī)學知識臺式離心機43細胞工程學醫(yī)學知識高速冷凍離心機44細胞工程學醫(yī)學知識高速冷凍離心機44細胞工程學醫(yī)學知識8、細胞冷凍貯存裝置 1液氮罐 2超低溫冰箱 45細胞工程學醫(yī)學知識8、細胞冷凍貯存裝置 1液氮罐 45細胞工程學醫(yī)學知識液氮罐超低溫冰箱46細胞工程學醫(yī)學知識液氮罐超低溫冰箱46細胞工程學醫(yī)學知識9.其它儀器設備 （1）清洗裝置： 浸泡器皿、沖洗水槽、超聲波玻璃器皿洗滌機等。 47細胞工程學醫(yī)學知識9.其它儀器設備 （1）清洗裝置：47

16、細胞工程學醫(yī)學知識（2）酸 度 機： 甘汞電極酸度計 電子精密酸度計 48細胞工程學醫(yī)學知識（2）酸 度 機：48細胞工程學醫(yī)學知識甘汞電極酸度儀49細胞工程學醫(yī)學知識甘汞電極酸度儀49細胞工程學醫(yī)學知識（3）天 平 電子天平 電光天平 普通天平50細胞工程學醫(yī)學知識（3）天 平50細胞工程學醫(yī)學知識（4）消化設備恒溫水浴鍋 恒溫磁力攪拌器旋渦震蕩器51細胞工程學醫(yī)學知識（4）消化設備恒溫水浴鍋 51細胞工程學醫(yī)學知識三、實驗室器具器皿52細胞工程學醫(yī)學知識三、實驗室器具器皿52細胞工程學醫(yī)學知識1、金屬器具解剖剪刀止血鉗鑷子刀片解剖刀53細胞工程學醫(yī)學知識1、金屬器具解剖剪刀止血鉗鑷子刀片解

17、剖刀53細胞工程學醫(yī)學知2、玻璃器皿和塑料器皿 54細胞工程學醫(yī)學知識2、玻璃器皿和塑料器皿 54細胞工程學醫(yī)學知識3、輔助工具各式移液器55細胞工程學醫(yī)學知識3、輔助工具各式55細胞工程學醫(yī)學知識第三節(jié)培養(yǎng)器具器皿的清洗、包裝、消毒56細胞工程學醫(yī)學知識第三節(jié)56細胞工程學醫(yī)學知識一、清洗與包扎 清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面防止細菌污染，另一方面有利于細胞的粘附和生長。玻璃表面性質與細胞的粘附和生長能力有關。 57細胞工程學醫(yī)學知識一、清洗與包扎 清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面防止1清洗玻璃器皿的流程浸泡 洗滌 沖洗 烘干 酸浸 沖洗 蒸餾水沖洗 瀝水 烘干 包扎58細胞工程學醫(yī)學知識1清

18、洗玻璃器皿的流程浸泡 洗滌 沖洗 洗 滌 劑1洗潔凈類2強氧化劑類強酸洗液的配制：弱液： 重鉻酸鉀 50g 蒸餾水 1000ml 濃硫酸 90ml 強液： 重鉻酸鉀 120g 蒸餾水 1000ml 濃硫酸 160ml(先加熱溶解重鉻酸鉀，冷后緩緩加入濃硫酸)59細胞工程學醫(yī)學知識洗 滌 劑1洗潔凈類59細胞工程學醫(yī)學知識2、清洗橡膠制品的流程 新制品：浸泡 堿煮（0.5mol/L NaOH 30min） 沖洗 酸煮（0.5mol/L HCl 30min） 沖洗 蒸餾水沖洗 烘干 包扎舊制品：水煮 沖洗 蒸餾水沖洗 烘干 包扎 60細胞工程學醫(yī)學知識2、清洗橡膠制品的流程 新制品：60細胞工程學

19、醫(yī)學知識3、清洗金屬制品的流程 75%酒精擦洗超凈臺處吹干包扎 61細胞工程學醫(yī)學知識3、清洗金屬制品的流程 75%酒精擦洗61細胞工程學醫(yī)學知識二、消毒滅菌 62細胞工程學醫(yī)學知識二、消毒滅菌 62細胞工程學醫(yī)學知識消毒方法分為三類：物理消毒法化學消毒法抗生素抑菌法63細胞工程學醫(yī)學知識消毒方法分為三類：63細胞工程學醫(yī)學知識（一）物理消毒法 1、高壓蒸氣消毒玻璃器皿 15磅 121 30分橡膠制品 15磅 121 15分 塑料制品 5磅 108 15分64細胞工程學醫(yī)學知識（一）物理消毒法 1、高壓蒸氣消毒64細胞工程學醫(yī)學知識2、干熱消毒 消毒耐高溫的材料器皿， 如玻璃、金屬等。 一般

20、160 60分鐘。 注意：冷卻后才能打開烘箱門 ，防止玻璃爆裂或起火燃燒。65細胞工程學醫(yī)學知識2、干熱消毒 消毒耐高溫的材料器皿，65細胞工程學醫(yī)3、濾過消毒（1）負壓濾過 （2）正壓濾過 66細胞工程學醫(yī)學知識3、濾過消毒（1）負壓濾過 （2）正壓濾過 66細胞工程學醫(yī)4、紫外線消毒 環(huán)境消毒5、輻射消毒 由60Co產生的射線，穿透力強，滅菌物品不升溫。6、煮沸消毒 適宜于臨時需要消毒的耐熱物品，如金屬器具和注射器等在水中煮沸2030分鐘即可用。 67細胞工程學醫(yī)學知識4、紫外線消毒67細胞工程學醫(yī)學知識（二）化學消毒法 化學消毒劑，包括酒精、新潔爾滅、來蘇兒、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷、碘酒、戊

21、二醛等。 68細胞工程學醫(yī)學知識（二）化學消毒法68細胞工程學醫(yī)學知識（三）抗生素消毒法 抗生素消毒作用主要是抑制液體內的細菌繁殖，因此適用于細胞培養(yǎng)用液的消毒。實驗室常用的是青、鏈霉素混合液也稱“雙抗”液，還有卡那霉素液等，其抑菌效果均很好。 69細胞工程學醫(yī)學知識（三）抗生素消毒法69細胞工程學醫(yī)學知識培養(yǎng)用品清洗和消毒程序70細胞工程學醫(yī)學知識培養(yǎng)用品清洗和消毒程序70細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)實驗必須注意什么？71細胞工程學醫(yī)學知識 細胞培養(yǎng)實驗必須注意什么？71細胞工程學醫(yī)學知識第四節(jié) 培養(yǎng)用液的制備 72細胞工程學醫(yī)學知識第四節(jié) 72細胞工程學醫(yī)學知識一、培養(yǎng)用液的組成 1水 作

22、用：（1）細胞賴以生存的主要條件；（2）維持細胞形態(tài)；（3）進行生物化學反應；（4）溫度傳導；（5）調節(jié)滲透壓和酸堿度的平衡。 73細胞工程學醫(yī)學知識一、培養(yǎng)用液的組成 73細胞工程學醫(yī)學知識2平衡鹽溶液 用途：洗滌組織、細胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎溶液。作用：（1）維持滲透壓；（2）調控酸堿平衡；（3）供給細胞生存所需能量和無機離子成分。 74細胞工程學醫(yī)學知識2平衡鹽溶液 74細胞工程學醫(yī)學知識3、天然培養(yǎng)基 血清、組織提取液（如雞血漿、雞胎汁等），血清是一種廣泛應用的天然培養(yǎng)基，市場有售，血漿應用較少，用時多自己制備。 75細胞工程學醫(yī)學知識3、天然培養(yǎng)基 血清、組織提取液（如雞血漿、

23、雞胎（1）雞血漿的制備？76細胞工程學醫(yī)學知識（1）雞血漿的制備76細胞工程學醫(yī)學知識（2）雞胚浸出液的制備 77細胞工程學醫(yī)學知識（2）雞胚浸出液的制備 77細胞工程學醫(yī)學雞胚浸出液的制備過程78細胞工程學醫(yī)學知識雞胚浸出液的制備過程78細胞工程學醫(yī)學知識（3）血 清 1） 種類： 人血清 胎牛血清 動物血清 牛血清 小牛血清 馬血清 79細胞工程學醫(yī)學知識（3）血 清 1） 種類：79細胞工程學醫(yī)學知識2）成分 蛋白質（血清的主要成分） 主要為白蛋白和球蛋白；如纖維粘連素能促進細胞附著；2巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；轉鐵蛋白能結合鐵離子，減少其毒性和被細胞所利用。80細胞工程學醫(yī)學知識2

24、）成分 80細胞工程學醫(yī)學知識 多肽 凝成血塊后析出的血清有增殖作用，要比去掉血細胞后分離出的血漿作用強。原因是在凝血過程中從血小板釋放出一種多肽血小板促生長因子（PDGF）的結果。81細胞工程學醫(yī)學知識 多肽 凝成血塊后析出的血清有增殖作用，要比 多肽血小板促生長因子（PDGF）是促細胞分裂多肽家族成員之一，是血清中主要促細胞增殖因子。PDGF有促成纖維細胞和膠質細胞增殖的作用，但對上皮細胞增殖的作用可能為促細胞分化。82細胞工程學醫(yī)學知識 多肽血小板促生長因子（PDGF）是促細胞分裂多肽家族 現已從組織中分離出其它生長因子如成纖維細胞生長因子（FGF）、表皮細胞生長因子（EGF）、增殖刺激

25、素（MSA）等，這些因子在血清中則含量不高。83細胞工程學醫(yī)學知識 現已從組織中分離出其它生長因子如成纖維細胞生長因子（ 激 素 激素多方面對細胞作用。胰島素（INS）有促細胞攝取葡萄糖和氨基酸的作用，這些作用可能與其促細胞分裂相關。84細胞工程學醫(yī)學知識 激 素 激素多方面對細胞作用。胰島素（INS）其 它 成 分血清中還含有：氨基酸葡萄糖酮酸一些與蛋白相結合狀態(tài)的微量元素一些抑制細胞增殖的成分 85細胞工程學醫(yī)學知識其 它 成 分血清中還含有：85細胞工程學醫(yī)學知識（4）水解乳蛋白 常用的天然培養(yǎng)基，水解乳蛋白是乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物。含有豐富的氨基酸；用與原代細胞培養(yǎng)效果很好。

26、 86細胞工程學醫(yī)學知識（4）水解乳蛋白 常用的天然培養(yǎng)基，水解乳蛋白是（5）膠 原 膠原是細胞生長良好的基質，是從動物組織中用人工的方法提取出的，利于組織和細胞的固定，屬于天然培養(yǎng)基。87細胞工程學醫(yī)學知識（5）膠 原 膠原是細胞生長良好的 膠原主要用于細胞的附著，能改善細胞表面的性質，促細胞生長。膠原可來自大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛真皮、牛眼水晶體等，其中以鼠尾膠原最為常用和制備簡便。88細胞工程學醫(yī)學知識 膠原主要用于細胞的附著，能改善細胞表面的性質，促細 例：鼠尾膠原制法如下：1）取組織：大鼠一只，從尾根切斷鼠尾，置75%酒精中浸泡30分鐘；無菌條件下，抽出尾腱置平皿中并切成1.5cm小段

27、；2）溶解：取1.5g尾腱浸入150ml醋酸溶液（0.010.25M），置4冰箱中，并不時搖動，48小時后，移入滅菌離心管；89細胞工程學醫(yī)學知識 例：鼠尾膠原制法如下：89細胞工程學醫(yī)學知識3）分離：4000轉/分，離心30分鐘，吸取上清液，10磅10分鐘高壓滅菌后分裝入小瓶，-20冰箱保存。4）使用方法：用吸管吸取少許膠原涂于滅菌培養(yǎng)瓶內壁上，不宜太厚以傾斜瓶時不流動為準；90細胞工程學醫(yī)學知識3）分離：4000轉/分，離心30分鐘，吸取上清液，10磅15）向培養(yǎng)瓶內通以氨氣后封上瓶蓋作用30分鐘（若不用氨氣處理，則置37溫箱過夜，或置室溫48小時，再用無菌水沖洗涼干）。待膠原凝固，然后用

28、無菌生理鹽水沖洗、涼干，即可使用。91細胞工程學醫(yī)學知識5）向培養(yǎng)瓶內通以氨氣后封上瓶蓋作用30分鐘（若不用氨氣處理4、合成培養(yǎng)基 （1）定義：按人和動物體內細胞成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養(yǎng)基。 92細胞工程學醫(yī)學知識4、合成培養(yǎng)基 （1）定義：按人和動物體內細胞成分模擬合成 合成培養(yǎng)基的出現，促進了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個體差異的影響。目的在于創(chuàng)制出與體內相似的生存環(huán)境。合成培養(yǎng)基有固定的組成成分，有利于控制實驗條件的標準化。93細胞工程學醫(yī)學知識 合成培養(yǎng)基的出現，促進了組織培養(yǎng)的發(fā)展，減少了生物個（2）合成培養(yǎng)基的成分氨基酸：幾乎所有細胞對谷氨酰胺有較高要求，是細胞賴以

29、合成核酸和蛋白質的物質。缺少谷氨酰胺細胞會因生長不良而死亡。維生素：維持細胞生長的生物活性物質，對細胞代謝有重大影響。可分為水溶性和脂溶性兩大類。 94細胞工程學醫(yī)學知識（2）合成培養(yǎng)基的成分94細胞工程學醫(yī)學知識無機離子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，還需一些微量元素，如Cu2、Zn2、Fe2等。碳水化合物：細胞生命的能量來源，也有一些是蛋白質和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉、醋酸鈉等。95細胞工程學醫(yī)學知識無機離子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，還需一些微量元素其它成分抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽等三磷酸酰苷（ATP）輔酶A核酸降解物如嘌呤與嘧啶類 96細胞工程

30、學醫(yī)學知識其它成分抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽等96細胞工程學醫(yī)學知識（3）合成培養(yǎng)基的分類 97細胞工程學醫(yī)學知識（3）合成培養(yǎng)基的分類 97細胞工程學醫(yī)學知識生長培養(yǎng)液 用以維持細胞生長增殖。含血清比例大，是培養(yǎng)工作中最主要的培養(yǎng)用液，其組成為： 基本培養(yǎng)基 80%90% 血清(多用小牛血清) 10%20% 抗生素(多用青霉素100u/ml和鏈霉素100u/ml)98細胞工程學醫(yī)學知識生長培養(yǎng)液 98細胞工程學醫(yī)學知識維 持 液 維持細胞緩慢生長或不死，血清含量很少，一般細胞因缺少生長因子時不能增殖，生長緩慢，但發(fā)生轉化或癌細胞因自身有產生促生長增殖因子的能力，在血清缺少情況下仍能生長；可

31、用于選擇發(fā)生惡性轉化的細胞。99細胞工程學醫(yī)學知識維 持 液 維持細胞緩慢生長或不死，血清含量很少其組成為： 基本培養(yǎng)基 95% 血清 2%5% 注意：如果培養(yǎng)正常細胞完全不加血清，可維持細胞不死，但時間過長細胞難免退化。 100細胞工程學醫(yī)學知識其組成為： 100細胞工程學醫(yī)學知識合成培養(yǎng)基的種類Eagle，s、Dulbecco，、Ham，s、CMRL、RPMI、Waymouth，s、MoCoy，s、Iscove，sMEM 、F12、 1066 、 1640 、 MB751/1 、 5A 、 DMEML15、 NCTC109、 199、 Fischer 101細胞工程學醫(yī)學知識合成培養(yǎng)基的種

32、類Eagle，s、Dulbecco，、Ham，細胞工程學醫(yī)學知識培訓課件 血清中還有一些有害物和抑制物，對細胞有去分化的作用，影響細胞的功能表達。因此，許多研究工作需要在培養(yǎng)基中不含血清和其他天然培養(yǎng)基。 無血清培養(yǎng)基研制難度大，要設計出一種萬能的無血清培養(yǎng)基非常困難。103細胞工程學醫(yī)學知識 血清中還有一些有害物和抑制物，對細胞有去分化的 繼續(xù)設計新的、能適應多種類型體外生長增殖的無血清培養(yǎng)基。在研究生長因子等工作的基礎上，向人工合成培養(yǎng)基內補加一定的激素、生長因子等已知物質來支持細胞的生長和增殖。 無血清培養(yǎng)基設計趨勢104細胞工程學醫(yī)學知識 無血清培養(yǎng)基設計趨勢104細胞工程學醫(yī)學知識6其它常用液 105細胞工程學醫(yī)學知識6其它常用液 105細胞工程學醫(yī)學知識（1）消化液 分離組織和分散細胞用的。如：胰蛋白酶、膠原酶、二乙胺四乙酸二鈉（EDTA）。 106細胞工程學醫(yī)學知識（1）消化液106細胞工程學醫(yī)學知識胰蛋白酶 采自?；蜇i的胰臟,易潮解，置于陰暗干燥處保存。 主要作用：水解細胞間蛋白質，使細胞相互離散。 活力表示：以解離酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和特性有密切的關系。濃度大、溫度高、作用時間越長，對細胞的分離能力最大，但