生化技術(shù)課件第二章沉淀

1、第二章生物大分子的純化方法蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題達(dá)到足夠純度的生物大分子的制備工作作為前題 。概 述 沉淀法（包括：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等）離心吸附層析、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、親和層析快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。常用的分離純化方法和技術(shù)有：沉淀法沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過(guò)程?；驹恚喝芙舛鹊牟煌煌芙舛鹊漠a(chǎn)生的原因：親和力的差異溶解度的大小與下列因素有關(guān)：溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)加入某些沉淀劑溶液的pH值、離子強(qiáng)度和極性中性鹽沉淀法（鹽析法）有機(jī)溶劑沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法有機(jī)聚合物沉淀選擇性沉淀法（熱

2、變性沉淀和酸堿變性沉淀）結(jié)晶沉淀法 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：中性鹽沉淀（鹽析法）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過(guò)程稱為“鹽析”。在蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用最廣，其突出的優(yōu)點(diǎn)： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡(jiǎn)單、安全。 對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。 中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理 鹽分級(jí)沉淀：多次鹽析的應(yīng)用中性鹽的選擇： 常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：1) 溶解度大： 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9

3、 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 1012) 分離效果好3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用 4) 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境缺點(diǎn)：需要一定時(shí)間脫鹽鹽析的操作方法：固體法、飽和溶液法、透析法最常用的是固體硫酸銨加入法原則：緩慢均勻少量 在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過(guò)濾方法各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄（p24-25）中查出。鹽析曲線的制作如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：取待分離樣品溶液(已定量測(cè)定蛋白質(zhì)或酶的活性與濃度)，冷至05，調(diào)至該蛋白

4、質(zhì)穩(wěn)定的pH值，分610次分別加入不同量的硫酸銨第一次加硫酸銨至蛋白質(zhì)溶液剛剛開始出現(xiàn)沉淀時(shí)，記下所加硫酸銨的量，這是鹽析曲線的起點(diǎn)繼續(xù)加硫酸銨至溶液微微混濁時(shí)，靜止一段時(shí)間，離心得到第一個(gè)沉淀級(jí)分，然后取上清再加至混濁，離心得到第二個(gè)級(jí)分，如此連續(xù)可得到610個(gè)級(jí)分按照每次加入硫酸銨的量，在附錄中查出相應(yīng)的硫酸銨飽和度。將每一級(jí)分沉淀物分別溶解在一定體積的適宜的pH緩沖液中，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和酶活力以每個(gè)級(jí)分的蛋白質(zhì)含量和酶活力對(duì)硫酸銨飽和度作圖，即可得到鹽析曲線 蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽和度 1) 蛋白質(zhì)的濃度： 較適中

5、的濃度0.2 % 2.0%2) pH值對(duì)鹽析的影響：pI 3) 溫度的影響：離子強(qiáng)度 04 鹽析的影響因素：主要鹽析常數(shù)Ks常用方法：凝膠過(guò)濾法和透析法透析法：脫鹽基本原理降低水溶液的介電常數(shù)，使溶劑的極性減小有機(jī)溶劑脫水作用有機(jī)溶劑沉淀法 分辨能力比鹽析法高 沉淀不用脫鹽，過(guò)濾比較容易 其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是：有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算與水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。進(jìn)行沉淀操作時(shí)，欲使溶液達(dá)到一定的有機(jī)溶劑濃度，需要加入的有機(jī)溶劑的濃度和體積可按下式計(jì)算： V = V0 (S2 S1) (100S2)溫度： 一般規(guī)律是溫

6、度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高 樣品濃度：蛋白質(zhì)初濃度： 5mg/mL20mg/mLpH值：pI附近離子強(qiáng)度：鹽濃度5%，V2倍有機(jī)溶劑沉淀的影響因素僅對(duì)一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用堿性蛋白質(zhì)、凝集素、種金屬蛋白質(zhì)沉淀法聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4)(Polyethylene Glycol , PEG )親水性強(qiáng)，溶于水和許多有機(jī)溶劑對(duì)熱穩(wěn)定有廣范圍的分子量在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為400 6000 的 PEG 有機(jī)聚合物沉淀法本方法的優(yōu)點(diǎn)：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子沉淀后有機(jī)聚合物容易去除

7、原理：利用理化性質(zhì)等方面的差異 熱變性 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性 選擇性酸堿變性 選擇性變性沉淀法在特定的條件下，改變?nèi)芙舛犬a(chǎn)生沉淀的方法。不等同于等電點(diǎn)沉淀法結(jié)晶沉淀法：透析自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有近150年。透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分離純化技術(shù)之一作用:除鹽除少量有機(jī)溶劑除去生物小分子雜質(zhì)濃縮樣品半透膜：纖維素將半透膜制成袋狀袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止 “保留液”“滲出液”或“透析液” MwCO擴(kuò)散壓(透析的動(dòng)力) 透析的速度: 膜的厚度 溶質(zhì)的濃度梯度 膜的面積 溫度檢查透析效果的方法是：用 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用 AgN

8、O3 檢查NaCl、KCl等制備核酸DNA-蛋白質(zhì)(DNP)RNA-蛋白質(zhì)(RNP)去污劑有機(jī)溶劑蛋白水解酶DNPRNP復(fù)合物的解聚十二烷基硫酸鈉(SDS)或Tween40 乙酸鉀溶液 離心除去沉淀物上清液即為初步純化的核酸制品(1)去污劑苯酚、氯仿 上層水相(含核酸)和下層有機(jī)相界面：變性凝聚蛋白 收集水相(2)有機(jī)溶劑 水相和有機(jī)相的位置充分接觸，速度適當(dāng)苯酚重新蒸餾異戊醇混合液 注意點(diǎn) ：溶菌酶蛋白酶K 蛋白酶E (需滅活DNase)(3)蛋白水解酶雜質(zhì)的消除(1)多糖 體內(nèi)的糖原和淀粉自然分解選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，適用于酸性多糖)(2)DNA與RNA的分離 鹽析法 DNA和RNA在NaCl溶液中溶解度不同 1-2mol/L; 0.14mol/L 酶水解法 DNase和RNase核酸沉淀(1)有機(jī)溶劑 乙醇-鹽溶液 DNA片段1kb或核酸溶液濃度1kb的核酸溶液，置室