蠅蛆甲殼素的制備技術(shù)研究

1、蠅蛆甲殼素的制備技術(shù)研究【摘要】目的研究蠅蛆甲殼素的制備技術(shù)，優(yōu)選出適宜制備工藝。方法蠅蛆甲殼素的制備采用酸堿法，產(chǎn)物含氮量測定采用凱氏定氮法，灰分含量測定采用550灼燒法。結(jié)果脫蛋白最正確工藝為以4%NaH室溫浸泡兩天，并更換NaH1次；脫色工藝使用1%Kn4；最正確脫鈣工藝為2lL-1鹽酸在25下反響6h。結(jié)論使用酸堿法制備的蠅蛆甲殼素質(zhì)量指標可達食品級甲殼素標準?！娟P(guān)鍵詞】昆蟲資源；蠅蛆；甲殼素；制備甲殼素是自然界中唯一帶正電荷的一種天然高分子聚合物，是保護生物的一種構(gòu)造物質(zhì)，結(jié)晶構(gòu)造鞏固，一般不熔化，也不溶于一般的有機溶劑和酸堿，只溶于濃酸和某些溶劑?；瘜W性質(zhì)非常穩(wěn)定，應(yīng)用有限1。自然

2、界中的甲殼素大多總是和不溶于水的無機鹽及蛋白質(zhì)嚴密結(jié)合在一起。人們?yōu)榱双@取甲殼素，往往將甲殼動物的外殼通過化學法或微生物法來制備。家蠅屬于再生資源，在昆蟲世界里，蒼蠅的繁殖才能位居第一，干蛆中甲殼素的含量高于蝦蟹中甲殼素的含量，因此更具有可利用價值2。本文采用貴州琨恩生物技術(shù)公司利用釀造茅臺酒的酒糟飼養(yǎng)的蠅蛆制備蠅蛆甲殼素，并進一步脫乙酰制成殼聚糖將另文報道，有利于擴大殼聚糖的來源，充分發(fā)揮資源優(yōu)勢。1材料與儀器1.1材料蠅蛆，貴州琨恩生物技術(shù)公司；氫氧化鈉化學純，分析純；濃鹽酸化學純；高錳酸鉀化學純；草酸化學純；濃硫酸分析純；硫酸鉀分析純；硫酸銅分析純。1.2儀器HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電

3、器；RAT玻璃反響釜，上海生物科技；凱氏定氮儀，上海第二玻璃儀器廠；KD型可調(diào)恒溫電熱套，山東華魯電熱儀器；馬弗爐，上海路達實驗儀器；2022電熱恒溫鼓風枯燥箱，上海路達實驗儀器。2方法2.1樣品制備取清洗干凈的新穎蠅蛆，置中藥粉碎機中破碎。漿料置篩中清洗并過濾，所得蛆皮沸水浴浸泡后過濾清洗。蛆皮低溫枯燥備用。2.2提取工藝樣品氫氧化鈉脫蛋白高錳酸鉀、草酸脫色鹽酸脫鈣蠅蛆甲殼素產(chǎn)品脫蛋白工藝及脫鈣工藝參數(shù)確實定采用正交實驗法，脫色工藝采用單因素實驗法。2.3制備工藝研究2.3.1脫蛋白工藝的正交實驗研究精細稱取數(shù)份枯燥蛆皮，分別參加不同濃度NaH，在不同溫度水浴中保溫反響，攪拌。反響完畢后，過

4、濾，枯燥。用凱氏定氮法測定含氮量。實驗結(jié)果為3次實驗的平均值。采取正交實驗法對蠅蛆皮脫蛋白工藝進展優(yōu)眩選擇NaH濃度、反響溫度和時間作為考察因素，以產(chǎn)物含氮量為評價指標，用L934正交表安排正交實驗，所選因素程度及正交實驗方案見表1。表1蠅蛆皮脫蛋白正交實驗因素程度略2.3.2室溫、兩次NaH處理對脫蛋白程度的影響精細稱取數(shù)份枯燥蛆皮，分別參加2，4，6，8NaH，室溫浸泡24h后，攪拌，同法用新穎NaH再處理1次。2.3.3脫色工藝的研究高錳酸鉀的濃度對脫色效果的影響:取數(shù)份除去蛋白質(zhì)的樣品，分別用0.5，1Kn4避光浸泡數(shù)小時，清水洗滌至中性，用1%草酸浸泡數(shù)小時，過濾，水洗至中性，低溫枯

5、燥。草酸浸泡次數(shù)對脫色效果的影響：取數(shù)份除去蛋白質(zhì)的樣品，用1Kn4避光浸泡數(shù)小時，清水洗滌至中性，過濾，分別用1%草酸浸泡1次、兩次，每次3h。過濾，水洗至中性，低溫枯燥。2.3.4脫鈣工藝的正交實驗研究精細稱取數(shù)份經(jīng)脫蛋白和脫色的樣品，分別參加鹽酸，不同溫度浸泡并攪拌。反響完畢后，蒸餾水洗滌至中性，置105烘箱枯燥恒重后測定灰分含量。實驗結(jié)果為3次實驗的平均值。采取正交實驗法對蠅蛆皮脫鈣工藝進展優(yōu)眩選擇鹽酸濃度、反響溫度和時間作為考察因素，以產(chǎn)物灰分含量為評價指標，用L934正交表安排正交實驗，所選因素程度及正交實驗方案見表2。表2蠅蛆皮脫鈣正交實驗因素程度略2.4產(chǎn)物的純化蠅蛆皮經(jīng)脫蛋白

6、、脫色及脫鈣處理后，60枯燥，將所得甲殼素混懸于蒸餾水置大燒杯中，加熱，保持微沸狀態(tài)，分層去處雜質(zhì)。2.5產(chǎn)品指標測定含氮量測定采用凱氏定氮法，灰分含量測定采用550灼燒法。2.6產(chǎn)品的紅外鑒定將產(chǎn)品蠅蛆甲殼素枯燥至恒重，與KBr混合研磨、壓片，在4004000-1測紅外光譜圖。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1甲殼素的制備工藝研究3.1.1脫蛋白工藝的正交實驗研究按照L934正交實驗設(shè)計表分別進展9次實驗。實驗結(jié)果見表3，極差分析結(jié)果見表4。表3蠅蛆皮脫蛋白正交實驗結(jié)果略表4蠅蛆皮脫蛋白正交實驗極差結(jié)果分析略因素A為反響時間，因素B為NaH濃度，因素為反響溫度由正交實驗結(jié)果和極差分析結(jié)果可知

7、，RBRRA，即在反響時間、反響溫度、NaH濃度這3個影響因素中，NaH濃度對樣品的含氮量影響最大，即對脫蛋白效果影響最大。其次是溫度，最后是反響時間。其最優(yōu)方案為此A3B33，此3個因素對甲殼素脫蛋白均有較大影響。3.1.2NaH濃度對室溫、兩次NaH處理對脫蛋白程度的影響結(jié)果見表5。表5NaH濃度對脫蛋白程度的影響略從節(jié)約能源的角度出發(fā)，考察室溫條件下堿處理脫蛋白的可行性。反響結(jié)果說明，室溫下，NaH濃度越大，產(chǎn)物含氮量越低，蛋白質(zhì)的脫除越徹底。以4NaH浸泡兩天，并更換堿液1次，也可到達制備要求。3.2脫色工藝的研究不同脫色工藝處理后的樣品取相等的量,用一樣大小的培養(yǎng)皿盛放,編號。脫色效

8、果的觀察采用3人雙盲法按樣品顏色從淺至深排序。結(jié)果1Kn4脫色效果優(yōu)于0.5Kn4。兩次草酸浸泡脫色效果顯著優(yōu)于一次草酸浸泡，原因是高錳酸鉀為強氧化性脫色劑，反響后樣品變?yōu)樽虾谏菟岬淖饔檬浅ザ嘤嗟母咤i酸鉀，兩次處理能較完全除掉多余的高錳酸鉀，使樣品非常潔白。比擬理想的脫色工藝是用1Kn4避光浸泡數(shù)小時，清水洗滌數(shù)次至中性，過濾，再用1%草酸浸泡數(shù)小時，換用1次草酸，脫色效果良好。3.3蠅蛆皮脫鈣正交實驗按照L934正交實驗設(shè)計表分別進展9次實驗，實驗結(jié)果見表6、極差分析結(jié)果見表7。表6蠅蛆皮脫鈣正交實驗結(jié)果略表7蠅蛆皮脫鈣正交實驗極差結(jié)果分析略由正交實驗結(jié)果和極差分析結(jié)果可知，RRARB

9、，即在反響時間、反響溫度、堿濃度這3個影響因素中，反響時間對樣品的灰分含量影響最大，即對脫鈣效果影響最大，其次是酸濃度，最后是反響溫度。從極差來看，此3因素對樣品的灰分含量影響都不大。其最優(yōu)方案為此A3B33，鑒于反響溫度對脫鈣效果影響很小，所以從經(jīng)濟的角度考慮，最優(yōu)方案為A3B13。3.4產(chǎn)物的純化蠅蛆皮經(jīng)脫蛋白、脫色及脫鈣處理后，60枯燥，得到無黑點的淺黃白色產(chǎn)品。為了進一步純化產(chǎn)物，我們將所得甲殼素混懸于蒸餾水置大燒杯中，加熱，保持微沸狀態(tài)，可見混懸其中的甲殼素分為3層：上層黃色，中層乳白色，下層純白色。將各層別離，枯燥，中、下層即為成品甲殼素；上層量較少，為黃色油脂狀物，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)此物

10、不溶于酸、堿，亦不溶于乙醚、石油醚等有機溶劑。3.5產(chǎn)物的鑒別蠅蛆皮脫蛋白脫鈣的產(chǎn)物是甲殼素，其紅外光譜見圖1，由圖分析可知：3433.401是N-H伸縮振動的吸收峰與-H伸縮振動的吸收峰，由于甲殼素分子中存在大量氫鍵，導致該頻率下的譜帶強而寬。2858.572924.991是H伸縮振動的吸收峰。1629.801，1576.711是酰胺I譜帶，前者可能是=與-H的氫鍵造成的，而后者是=0與N-H的氫鍵造成的，說明分子中有乙酰胺基存在。N-H的面內(nèi)彎曲與N伸縮振動是混合在一起的，其中之一是1425.071酰胺II譜帶，另一個那么是1378.481(酰胺III譜帶)。在甲殼素的光譜中表現(xiàn)1321.

11、481的搖擺振動也包含在這個吸收峰中。從上述結(jié)果分析中可知，此樣品為甲殼素。4討論4.1脫蛋白工藝在脫蛋白反響過程中，反響時間、反響溫度、NaH濃度這3個影響因素，NaH濃度對樣品的含氮量影響最大，其次是溫度，最后是反響時間。其最優(yōu)方案為8NaH,在80下反響3h,可制得脫蛋白較完全的甲殼素。NaH濃度是脫蛋白工藝的主要影響因素，溫度也是脫蛋白工藝的主要影響因素。稀堿脫蛋白的反響原理為蛋白質(zhì)被堿催化水解，在水解過程中，逐漸降解成分子量越來越小的肽段，直到最后變成氨基酸的混合物。從實驗結(jié)果可見，隨著NaH濃度的進步，反響溫度的升高，反響時間的延長，產(chǎn)物的含氮量降低，但含氮量降質(zhì)至45時，不再下降

12、。由于蠅蛆皮中蛋白含量低，高濃度堿液不利于降低本錢和環(huán)境保護，而且過于劇烈的反響條件，可能會破壞甲殼素的分子構(gòu)造和功能特性，使產(chǎn)物色澤加深，影響產(chǎn)物質(zhì)量。綜合考慮各方面因素，蠅蛆皮脫蛋白的最正確工藝為以4NaH室溫浸泡兩天，并更換NaH一次。4.2脫色工藝甲殼素的脫色，主要是將甲殼素的顏色去除，使甲殼素顏色變淺，另一方面，也包括了將甲殼素中殘留的蛆頭、口器等黑點去掉，進步甲殼素的白度，以便于加工消費成淺色產(chǎn)品，改善甲殼素的外觀性狀，進步產(chǎn)品檔次，從而進步原料的利用價值。比擬理想的脫色工藝是用1Kn4避光浸泡數(shù)小時，清水洗滌數(shù)次至中性，過濾，再用1%草酸浸泡數(shù)小時，換用一次草酸，脫色效果良好。在

13、脫色之前，甲殼素不宜粉碎成較小顆粒，以免被氧化降解，形成更小顆?；蚣毞勰?，影響產(chǎn)物回收率，降低得率。更重要的是，脫色過程中要保護甲殼素本身所具有的各項性能指標，高錳酸鉀作用時間也要嚴格控制，以免作用時間過長加重甲殼素分子的降解程度，使最終產(chǎn)物殼聚糖分子量減小，黏度降低，從而影響其作用效果。同時，還要保護殼聚糖不被反響過程中產(chǎn)生的其它離子所污染，從而到達徹底脫色的目的。4.3脫鈣工藝在脫鈣反響過程中，反響時間、反響溫度、堿濃度這3個影響因素，反響時間對樣品的灰分含量影響最大，其次是酸濃度，最后是反響溫度。其最優(yōu)方案為2l/L鹽酸，在25下反響6h，可制得脫鈣較完全的甲殼素。用稀鹽酸浸泡脫鈣的原理在于用鹽酸處理后，蛆皮中的碳酸鈣等無機鹽轉(zhuǎn)化成它們的鹽酸鹽溶解于水中，同時產(chǎn)生碳酸，碳酸不穩(wěn)定，立即分解為二氧化碳和水，通過洗滌、別離，即可除去無機鹽。相對于蝦蟹殼來說，蠅蛆皮鈣含量本來就較低，因此，只要有足夠量的酸溶液，反響時間足夠長，碳酸鈣的分解反響即可順利進展，且進展程度較完全。從實驗結(jié)果可看出，反響的最低條件即1l/LHl,25，2h即可得到灰分含量為0.2左右的甲殼素，所以再進步反響條件，灰分含量的改變也不會太大。但