異種脫蛋白骨復(fù)合物修復(fù)大段骨缺損的血管化觀(guān)察

1、異種脫蛋白骨復(fù)合物修復(fù)大段骨缺損的血管化觀(guān)察簡(jiǎn)月奎，李起鴻，劉雷，楊柳【摘要】目的討論異種脫蛋白骨(hetergeneusdeprtEinbne，HDPB)復(fù)合物修復(fù)脛骨大段骨缺損過(guò)程中的血管化實(shí)驗(yàn)研究，為異種脫蛋白骨的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。方法山羊24只，在右側(cè)脛骨中下段截除脛骨總長(zhǎng)度20形成節(jié)段性骨缺損，實(shí)驗(yàn)組18只，植入異種DPB+自體Ss+rhBP2，用半環(huán)槽式外固定器固定。于術(shù)后每隔4周對(duì)3只進(jìn)展股動(dòng)脈墨汁灌注后處死，取新骨組織制成厚切片觀(guān)察血管化情況，以另6只植入自體骨為對(duì)照。結(jié)果術(shù)后424周，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血管表現(xiàn)數(shù)目逐漸增多，排列漸趨規(guī)那么，血管大孝分布區(qū)域趨向均勻。測(cè)量血管數(shù)

2、目和面積，結(jié)果顯示424周2組血管數(shù)目和面積統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性意義(P0.05)。結(jié)論異種脫蛋白骨復(fù)合物修復(fù)大動(dòng)物大塊骨缺損過(guò)程中血管化程度與自體骨相當(dāng)，可以作為組織工程支架材料，并對(duì)其免疫原性和成骨才能等性能進(jìn)展進(jìn)一步研究。【關(guān)鍵詞】異種脫蛋白骨；骨缺損；血管化；骨組織工程1材料與方法1.1主要儀器和試劑市售豬股骨;市售墨汁；20%甘露醇(西南藥業(yè)公司)；10甲醛、濃鹽酸、三氯化鐵(重慶化學(xué)試劑廠(chǎng))；半環(huán)槽式外固定器(第三軍醫(yī)大學(xué)李起鴻教授研制)；超低溫冰箱(NUAIR，USA)；速眠新(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所)；肝素鈉(天津生化制劑廠(chǎng))；氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份)。1.2異種DP

3、B的制備參照改進(jìn)法2制備，將制備的豬DPB放入-80超低溫冰箱冷凍3個(gè)月后取出，在-700Hg真空下包裝，60照射后置-4保存。DPB于術(shù)前浸入含rhBP2濃度為75ngl3溶液中2h備用。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組山羊(第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，1012個(gè)月齡，雌雄不限，分籠喂養(yǎng)，體重(22.52.5)kg。隨機(jī)均分2組，按植入材料分為實(shí)驗(yàn)組(異種DPB+自體Ss+rhBP2)和對(duì)照組(自體骨)。1.4山羊Ss培養(yǎng)及與異種DPB復(fù)合別離培養(yǎng)、搜集山羊Ss，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0106l，將細(xì)胞懸液接種于異種DPBrhBP2上，2l塊，放入37、52、飽和濕度的2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h再加含15FBS的

4、DEF12培養(yǎng)基1l，23d后常規(guī)換液。1.5動(dòng)物手術(shù)術(shù)前拍雙側(cè)脛骨X線(xiàn)片，測(cè)量脛骨干長(zhǎng)度，所有動(dòng)物骨缺損制備和外固定一樣，操作由同一組人員完成。半環(huán)槽式外固定器固定，所有螺母旋緊。根據(jù)X線(xiàn)片得到的脛骨長(zhǎng)度，右側(cè)脛骨中下段造成20骨和骨膜段缺損4，據(jù)分組植入不同的植入物，其中Ss均來(lái)自山羊自體骨髓。術(shù)后每隔4周攝肢體正側(cè)位X線(xiàn)片。肌注速眠新0.08l/kg，麻醉后固定，常規(guī)條件攝片。1.6配制墨汁及灌注市售墨汁過(guò)濾后，按721的比例將墨汁、10甲醛和20甘露醇混合配制成灌注液，6層醫(yī)用紗布過(guò)濾，用前恒溫水浴加熱至38。速眠新0.08lkg與氯胺酮2g/kg肌肉注射復(fù)合麻醉后固定，肝素1000U

5、kg肌注全身肝素化，在腹股溝區(qū)切開(kāi)皮膚、皮下組織，游離股、靜脈。結(jié)扎股動(dòng)脈、離斷，遠(yuǎn)端插管、固定；結(jié)扎股靜脈、離斷，遠(yuǎn)端切開(kāi)放血?？焖傧蚬蓜?dòng)脈遠(yuǎn)端推注大量肝素生理鹽水(每500L生理鹽水中參加肝素12500U)沖洗直至股靜脈流出清亮液體為止。然后從股動(dòng)脈注入38墨汁灌注液至股靜脈流出黑色液體，皮膚趾甲變黑，結(jié)扎股動(dòng)、靜脈。處死山羊，取下脛骨，低溫放置24h后10甲醛溶液中固定2周。進(jìn)展大體解剖及厚切片觀(guān)察新骨血管化情況。1.7大體解剖觀(guān)察切開(kāi)皮膚，暴露皮下組織和肌肉及剔除肌肉暴露骨膜，觀(guān)察皮下組織、肌肉和骨膜血管網(wǎng)。1.9統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展數(shù)據(jù)處理，數(shù)值以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)

6、表示，采用單因素方差分析進(jìn)展比擬。2結(jié)果2.1術(shù)后觀(guān)察所有實(shí)驗(yàn)山羊術(shù)后傷口無(wú)潰爛、流膿，無(wú)死亡。26h清醒，并能站立進(jìn)食。螺母松動(dòng)后及時(shí)旋緊，無(wú)外固定松動(dòng)失敗，皮膚無(wú)壞死。2d內(nèi)傷肢能落地，但不能負(fù)重，2周后可以局部負(fù)重，3周能細(xì)微跛行，4周后能自由活動(dòng)，無(wú)跛行。2.2大體解剖觀(guān)察肌肉和軟組織已經(jīng)被墨汁黑染，皮下、肌肉筋膜和骨膜可清楚的觀(guān)察到血管大孝分支、走行方向及互相吻合呈網(wǎng)狀。2.3影像學(xué)觀(guān)察術(shù)后4周骨缺損區(qū)出現(xiàn)植入物邊緣毛糙，8周出現(xiàn)大小不等、形狀不規(guī)那么的透光性骨吸收區(qū)。術(shù)后12、16、20、24周，2組表現(xiàn)為時(shí)間依從性的骨修復(fù)，表現(xiàn)為骨缺損區(qū)兩斷端之間高密度鈣化影，新生骨與兩斷端完全

7、相連接，大局部塑形，可見(jiàn)髓腔影(圖1)。表12組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)新骨血管數(shù)目比擬略2組比擬：P0.05表22組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)新骨血管面積比擬略?xún)山M比擬：P0.053討論異種骨的應(yīng)用主要是免疫原性和成骨才能，而移植后的血管化及其速度是評(píng)價(jià)去除免疫原性程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)，去免疫原性的程度能為受植的動(dòng)物所耐受。對(duì)新骨能否生成，血管化過(guò)程對(duì)骨再交融方式起決定性作用3，以往作為骨移植材料制備的異種骨多作為單純的充填物，或添加自體細(xì)胞或生長(zhǎng)因子進(jìn)展研究，這些實(shí)驗(yàn)在小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或大型動(dòng)物小段骨缺損修復(fù)獲得了成功4。在修復(fù)骨缺損的部位上，李曉輝等5添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與局部脫蛋白骨復(fù)合修復(fù)家兔股骨頭缺損獲

8、得良好的效果，但在大型動(dòng)物的大段骨缺損，特別是在血供較差，肌肉覆蓋較少的脛骨中下段修復(fù)報(bào)道較少。作者的改進(jìn)法在制備過(guò)程中盡量保存膠原蛋白，去除非膠原蛋白、肽類(lèi)及脂類(lèi)、細(xì)胞等，顯著降低了抗原性，同時(shí)保存了良好的力學(xué)強(qiáng)度、天然的網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，為細(xì)胞的黏附、增殖及分化提供良好的三維空間構(gòu)造，并參加骨誘導(dǎo)性細(xì)胞因子rhBP2，在植入前復(fù)合山羊自體Ss，使復(fù)合物既具有骨傳導(dǎo)性，又具有骨誘導(dǎo)性，促使其成骨才能增強(qiáng)。在一系列理化性能檢測(cè)、平安性及小動(dòng)物免疫原性及成骨研究的根底上6，本實(shí)驗(yàn)在修復(fù)羊脛骨干大段骨缺損過(guò)程時(shí)對(duì)組織工程骨的血管化問(wèn)題進(jìn)展了研究，結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)組山羊術(shù)后傷口無(wú)潰爛、流膿，無(wú)死亡，影像學(xué)顯示對(duì)骨缺損有完全修復(fù)。血管化過(guò)程表現(xiàn)為血管數(shù)量逐漸增多，血管分布逐漸均勻。血管面積圖像分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與自體骨移植修復(fù)組比擬，2組新骨的血管化程度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性意義(P0.05)，說(shuō)明本組研制的異種脫蛋白骨復(fù)合物修復(fù)大動(dòng)物長(zhǎng)骨大段缺損的血管