主要禽病的實驗室檢測方法及結果分析課件

1、主要禽病的實驗室檢測方法及結果分析張國中（中國農(nóng)業(yè)大學）2011年4月23日1（一）血清學檢測方法 1、免疫血清學技術抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性結合反應，因為抗體主要來自于血清，在體外進行的抗原抗體反應稱為血清學反應或免疫血清學技術。一、常用的實驗室檢測方法2血清學反應的一般特點高度特異性反應可逆性反應二階段性影響反應的因素32、血清學反應類型及常用試驗方法反應類型常用試驗名稱凝集試驗直接凝集試驗平板凝集試驗（SPA）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）沉淀試驗瓊脂免疫擴散試驗（AGP）中和試驗病毒中和試驗（VN）標記抗體技術酶標記技術酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）5（1）平板凝集試驗

2、（SPA）基本原理：細菌、紅細胞等顆粒狀抗原與相應抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。主要應用：雞白?。⊿P） 支原體（MG/MS）6圖1 平板凝集試驗檢測結果7（2）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集特定種類動物的紅細胞，此即紅細胞凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。主要應用：新城疫（ND） 禽流感（AI） 產(chǎn)蛋下降綜合癥（EDS） 雞傳染性支氣管炎（IB） 8（3）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）基本原理：可溶性抗原（毒素、病毒、細菌裂解液）與相應抗體結合, 在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的沉淀物。主要應用

3、：雞馬立克氏病病毒（MDV） 雞痘病毒（FPV）10（4）病毒中和試驗（VN）基本原理：抗原與相應的抗血清按適當比例混合作用后，可被中和而失去感染實驗動物、組織細胞或雞胚的能力。主要應用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血清分型。12圖5 采用中和試驗對疑似IBV分離物進行鑒定與分型空白對照病毒接種病毒+抗血清14（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）基本原理：抗原抗體反應的特異性 酶促反應的高效性使抗原（或抗體）結合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標物，這種酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留酶的活性。15主要應用：多種禽病檢測抗體檢測最常用ELISA

4、方法：間接法，是利用酶標記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測已與固相抗原結合的抗體。16圖6 間接ELISA方法測抗體的基本原理示意圖固相載體包被抗原待檢抗體酶標二抗底物顯色17考慮血清學檢測的目的血清樣品的采集方法采集血清樣品的數(shù)量血清樣品的標記血清樣品的貯藏及運輸3、血清學檢測應注意的問題18（2）病原分離主要目的進行疾病診斷疾病確診的黃金方法病原學研究的基礎20（3）病原分離方法細菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基病毒分離鑒定：雞胚、細胞或實驗動物接種212、聚合酶鏈式反應（PCR）（1）主要目的：通過對特異性基因片段的檢測達到檢測病原體的目的。（2）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性23圖7 常規(guī)R

5、T-PCR檢測結果（電泳圖）241、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡） （1）了解原產(chǎn)地的免疫種類了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護性水平確定需根據(jù)當?shù)厍闆r加免的疫苗根據(jù)抗體反應追蹤是否有過感染二、實驗室監(jiān)測方案的制定26（2）了解母源抗體水平根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時間了解雛雞免疫保護能力，便于疫病診斷272、免疫檢查 （1）免疫前檢查目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和進行免疫效果評價。 初免前檢查 再免前檢查28（3）定期檢查目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時采取補救措施，分析各種免疫之間的相關性，調(diào)整免疫程序。30（4）重要節(jié)點檢查3050d檢查（檢查前幾次免疫

6、效果）開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護性抗體需求）3640W檢查（確定抗體水平、適時補免）313、生產(chǎn)發(fā)生變動時的檢查 （1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測做為發(fā)病時檢查的參考數(shù)據(jù)做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向做為流行病學分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異32（2）雙份血清檢測鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對比分析有很好的診斷價值。33（3）抗原檢測某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染狀況的存在。34（4）未免疫雞群抗體檢測未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷十分重要。354、重要疫病流行動態(tài)分析流行動態(tài)分析對生產(chǎn)企業(yè)來

7、說，開展具有一定的難度，但對重要疫病，尤其是重點進行免疫防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料進行分析，會得到極為有益的技術支持。36流行動態(tài)分析需要進行大量工作，除抗體監(jiān)測外，必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離鑒定、動物實驗和必要的分子生物學研究。371、HI檢測結果與分析 （1）常見HI檢測結果1-3d15-25d25-35d35-50d50d開產(chǎn)前36w左右40wH5N125-720-320-423-526-727-925-627-9H9N225-920-323-524-727-829-1226-729-11ND25-920-323-525-827-1029-1227-829-

8、12三、重要疫病的常見檢查結果與分析38圖8 種雞開產(chǎn)前NDV抗體檢測情況39（2）免疫抗體空檔期15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時期野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達到最短40圖9 NDV母源抗體衰減情況41圖10 15-30日齡雛雞NDV抗體檢測情況42（3）HI檢查的抗體離散度在4lg2內(nèi)是允許范圍大于4lg2的基本原因初免時母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高-漏免太多疫苗質(zhì)量不好二免后離散度應達到要求43（4）抗體保護臨界值通過攻毒試驗加以驗證的結果AIV要求26NDV要求28-10臨界值是針對有效保護對等而言，即疫苗和流行

9、毒株有良好的相關性。當流行毒株變異而疫苗株保護性不足時，原有臨界值在一定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。44（5）診斷試劑問題抗原問題：抗原不純（影響HA的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異陽性血清問題：陽性血清不純45（6）診斷指標H5N1雙份血清檢測：應用常規(guī) Re-4、Re-5苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后10-14d可檢測出Re-4、Re-5抗體滴度上升22-3。未免相應疫苗的情況下，檢測變異株抗體達到26-9有診斷價值。46圖11 某肉種雞群發(fā)生H5感染前后抗體檢測結果（38W發(fā)生，2W產(chǎn)蛋率75%5%，死淘20%）47圖12 某肉種雞群H5感染后變

10、異株抗體檢測結果（換羽24W發(fā)生，降蛋10%，累計死亡率5%）48H9N2產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14天，HI抗體20%以上達到212以上有診斷價值。雛雞20-30d HI抗體達到26-9有診斷價值。49ND產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體213有診斷價值。雛雞20-35d HI抗體達到26-9有診斷價值。50圖13 某肉種雞群發(fā)生NDV感染后抗體檢測結果51HI診斷應注意的問題HI診斷應結合臨床表現(xiàn)，當臨床表現(xiàn)無異常而檢測結果異常時往往是檢測結果出了錯，應提高警惕。522、平板凝集試驗（SPA）檢測結果與分析 （1）可用于MG、MS、SP檢查 （2）可進行血清平板和全血平板，相對來說血清平板更準

11、確和易于判斷。53（3）SPA準確率相對較差，假陽性率高，一般群體檢查超過30%以上陽性才有確實群體感染的診斷意義。（4）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。543、瓊脂擴散試驗（AGP）檢測結果與分析 （1）可用于MD、POX和IC （2）對MD可進行抗體、抗原兩種檢測50d左右，50%以上抗體陽性預示疫苗反應正常用羽髓做瓊擴有發(fā)病診斷價值55（3）POX常不用檢測，通過觀察接種部位反應可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進行疫病診斷。（4）IC的瓊擴試劑很少，可從國外進口或選用日本北里所的間接血凝試劑。564、ELISA檢測結果與分析 （1）目前可應用ELISA檢測的疾病ND、AI MG、MS、

12、SPIB、IBD、REO、AE、 RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag57（2）常見ELISA檢測結果1-3d15-25d25-35d50d開產(chǎn)前產(chǎn)蛋期IB2000-80000-10001000-20002000-80002000-150002000-15000IBD2000-80000-15002000-40004000-100004000-100004000-12000REO2000-50000-5000-20002000-60002000-150002000-15000ILT2000-30000-10000-5002000-40002000-60002000-6000AE500-20000-5000-300300-6000300-8000500-8000CIA+ （0.3）+/-+/-+（0.1）+（15000預示存在野毒感染。應達到的指標在相應日齡檢測達不到，指示免疫失敗，應追蹤疫苗質(zhì)量和免疫技術。長期檢測有助于了解抗體變化規(guī)律，用于指導疫苗選擇和免疫程序的制定。按照常規(guī)做檢測，有利于發(fā)病診斷和監(jiān)督生產(chǎn)問題