鐵皮石斛 組織培養(yǎng) 栽培 試驗 實驗

1、鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)與栽培-I摘要：為試驗鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)與栽培，以鐵皮石斛莖段為外 植體，結(jié)合鐵皮石斛的生物學(xué)特性，綜述鐵皮石斛組織培養(yǎng)與栽培的 過程技術(shù)。觀察研究基本培養(yǎng)基、天然附加物和植物生長調(diào)節(jié)劑對鐵 皮石斛生長的影響。驗證和探究鐵皮石斛莖段組織培養(yǎng)技術(shù)并對鐵皮 石斛的組織培養(yǎng)與栽培管理技術(shù)進行了思考與展望。關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；組織培養(yǎng)；莖段；移栽；馴化0.引言鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是蘭科 (Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium Sw.)多年生草本植物，又名黑節(jié)草， 俗稱鐵皮楓斗，分布于云南、安徽、貴州、浙

2、江、江西、廣東和廣西 等地，是我國傳統(tǒng)名貴珍稀中藥材，其有效成分主要為石斛多糖、石 斛堿、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高達21.7%，能顯著提高機體 免疫功能，具有養(yǎng)胃出津、補腎益力、滋陰清熱、耐缺氧、抗疲勞、 抗腫瘤等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，石斛還具有抗衰老和擴張血管 的作用。鐵皮石斛喜蔭涼、濕潤的環(huán)境，常附在高海拔懸崖峭壁或林內(nèi)樹 干和巖石縫隙中。由于其藥用價值高、生長條件特殊和分布受局限， 且經(jīng)長期人為采挖，野生資源瀕臨滅絕。鐵皮石斛是2005版中華 人民共和國藥典收載的3種石斛屬植物之一，為石斛之極品，它因 表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛蒴果成熟時易開裂，且種子粒徑小， 自然繁殖率低，

3、是一種珍稀的藥用植物和和名貴的室內(nèi)觀賞植物.。鐵皮石斛自然繁殖力極低，常規(guī)繁殖又較困難，且多年來對鐵皮石斛的采集量遠大于其生長量，野生鐵皮石斛自然繁殖已瀕臨絕跡。由于 藥用價值高，人為的過度開采與生態(tài)破壞，野生鐵皮石斛已瀕臨滅絕， 1987年國務(wù)院將其列為國家重點保護植物。1材料與方法1試驗材料野生云南鐵皮石斛，取材于浙江農(nóng)林大學(xué)組培實驗室，取其莖段 作為外植體進行組織培養(yǎng)。1. 2試驗方法1. 2. 1外植體消毒取鐵皮石斛的莖，去除多余葉片后用解剖刀將莖切成含34 個節(jié)點的莖段，保留節(jié)點。依次用中性洗滌劑清洗，自來水沖洗 20min，用70%的乙醇浸泡1060 s，再轉(zhuǎn)入0.1%的氯化汞中，

4、 滅菌511 min后倒去氯化汞溶液，用無菌水反復(fù)漂洗材料3-5 次。用無菌紙吸去莖段上多余水分，將其切成12 cm帶一個芽點 的莖段，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。1. 2. 2培養(yǎng)基制備鐵皮石斛培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，0. 7%瓊脂，pH值為5. 8。 按不同目的在基本培養(yǎng)基中加入6-BA、NAA、IBA，每個培養(yǎng)瓶分 裝50 m培養(yǎng)基，密封。經(jīng)過121 C高溫滅菌25 min。不定芽的誘 導(dǎo)培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基MS中加入細胞分裂素和生長素，采用不 用濃度水平的NAA和6-BA。組培苗的壯苗與生根，將生長狀態(tài)穩(wěn)定的試管苗接種于添加不同激素組合的1/2 MS培養(yǎng)基上。(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA0.

5、5mg / I。+NAA 0.05mg / L+AC(活性炭)29 / L；MS+6-BAl. 0mg / L+NAA0. 1mg / L+AC29 / L。增殖培養(yǎng)基：花寶 3 號 39 / L+6 一 BA2. 5mg / L+NAA0. 25mg /I。+AC29/L。生根培養(yǎng)基:1 / 2 MS+IBA0. 5mg / L+AC29 / 1。培養(yǎng)基中添加蔗 糖 209/L, pH5. 25. 41. 2. 3培養(yǎng)條件接種鐵皮石斛培養(yǎng)材料的組培苗在組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 為(26 土 2) C,光照 14 h/d,光強 1 500 2 000 lx。1. 2. 4誘導(dǎo)培養(yǎng)用解剖刀將鐵

6、皮石斛的幼嫩莖段切下，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進 行培養(yǎng)。1520天后，外植體開始萌動，莖段膨大，切面及頂部組 織形成疏松組織。繼續(xù)培養(yǎng)20天后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中，切面及頂部 膨大組織的表面形成凹凸不平的顆粒物，隨著培養(yǎng)時間的延長，顆粒 物長大形成直徑12mm的類原球莖顆粒物。1. 2. 5增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)形成的原球莖轉(zhuǎn)入到增殖培養(yǎng)基中，原球莖增殖速度很 快，增殖倍數(shù)可達34倍，同時部分原球莖開始分化出芽點并長出 12片小葉，原球莖的增殖與芽分化同時進行。1. 2. 6生根培養(yǎng)取誘導(dǎo)形成的不定芽，要求芽高2 3 cm,帶3 5片葉的不 定芽，將其接種到不同處理的生根培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)30天 左右，基

7、部開始出現(xiàn)23條約1cm長的白色根，隨后逐漸伸長，生 根率達到90%以上。移栽與馴化2.1移栽前的準備2.1.1煉苗當苗高3cm以上、具34片葉時，便可煉苗。移栽前先將瓶苗 至煉苗房進行23周的煉苗，讓瓶苗從封閉穩(wěn)定的環(huán)境向開放變化的 環(huán)境過渡，慢慢適應(yīng)自然環(huán)境，等瓶苗生長健壯、葉色正常，根長 3cm以上，肉質(zhì)莖有34個節(jié)間、長有45片葉，葉色正常，根長 3cm以上，有45條根，根皮色白中帶綠，無黑色根，無畸形，無變 異。煉苗目的：煉苗的主要目的是使組培苗適應(yīng)外界的環(huán)境一一溫差，濕度差以 及微生物環(huán)境。煉苗方法：1）將待煉苗的材料放置于欲移栽的環(huán)境，不開蓋保持4-5天；2）半開蓋保持1-2天后

8、，全開蓋再煉苗2-3天2.1.2出瓶組培苗出瓶時，打開瓶塞將培養(yǎng)基與小苗一起輕輕取出，整齊放 置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分別放置。正常組培苗先 在自來水中洗凈培養(yǎng)基，特別要洗掉瓊脂，以免瓊脂發(fā)霉引起爛根， 再換自來水清洗一次。裸根或少根組培苗經(jīng)過上述清洗后，還需將小 苗根部置于100mg/L的ABT生根粉中浸泡15分鐘，以進行生根誘 導(dǎo)。污染苗經(jīng)過清洗后，用1000倍多菌靈浸泡整株小苗10分鐘。后 期管理得當可有效控制污染的發(fā)生。栽種于已滅菌的基質(zhì)中（移栽前 澆透水），放置在遮光度50%60%、濕度達80%以上的溫室中，2 個月后，成活率達90%以上。2.1.3基質(zhì)的準備移栽鐵皮石

9、斛組培苗要選擇適宜的基質(zhì)。鐵皮石斛的根是氣生 根，有明顯的好氣性和淺根性，因此，要求基質(zhì)以疏松透氣、排水良 好、不易發(fā)霉、無病菌和害蟲潛藏者為宜?？梢赃x擇水苔、石灰石、 碎磚、樹皮、刨花、蕨根、板邊、菌糠、木糠等為移栽基質(zhì)。鐵皮石斛不宜深植，種植時根系向四周均勻展開，將基質(zhì)填充根部、 基部必須露出，否則易造成爛根。移栽后隔5天再澆水效果較好。30 天內(nèi)每隔1天噴霧1次，水量不宜過多，期間勿施肥，待小苗恢復(fù)正 常生長后才開始常規(guī)的水肥管理。2.1.4栽培場地的選擇鐵皮石斛喜溫暖、多霧、微風(fēng)、清潔、散射光環(huán)境，忌陽光直射 和曝曬。在移栽過程中要創(chuàng)造條件，為鐵皮石斛創(chuàng)造最佳的生長環(huán)境。 鐵皮石斛原產(chǎn)

10、區(qū)大多處于溫帶和亞熱帶，全年氣候溫暖、濕潤，冬季 氣溫在0C以上。根據(jù)鐵皮石斛的生長習(xí)性，要考慮場地的光照、溫 度、濕度、通風(fēng)等自然因素。筆者認為最好選擇在大棚內(nèi)移栽，而且 要移栽在高架畦，這樣容易滿足鐵皮石斛生長的最佳環(huán)境要求，而且 很多自然因素容易控制。在建造育苗大棚時要滿足以下三個條件：（1）育苗大棚要通電、通水、通路，要求棚寬6m、長30m、棚 肩高107m以上、棚頂高2.8m以上，棚頂覆蓋塑料無滴薄膜和70% 遮蔭度的遮蔭網(wǎng)，棚內(nèi)安裝有自來水管，大棚四周和入口裝有40目 的防蟲網(wǎng)。有條件的，棚內(nèi)還要裝有自動或手動控制的噴霧系統(tǒng)（最 好既能噴霧，又能噴肥、噴藥），這樣可以防曬、防雨、防

11、蟲、保溫、 保濕、透氣，還能大大減少勞動量。（2）棚內(nèi)搭建畦底架空的高架種植畦?？捎媒卿摗⒋u頭、木條 或方條等材料作為種植畦的框架，然后鋪設(shè)孔徑為0.30.5cm的塑料 平板作為栽培基質(zhì)的支撐面，要求畦寬11.2m，畦長度可自定，畦 底架空高度3050cm。種植畦上方裝有可隨時噴霧的噴頭，噴霧餓時 間最好能控制。沒有條件的，也可以用噴霧器來代替。搭建高架種植 畦的目的是為了使水分和透氣容易控制，從而為組培苗生長提供最佳 水分，保證通風(fēng)透氣，又能同時噴肥噴藥，移栽成活率高，大面積移 栽時能大大節(jié)省勞動力。（3）在種植畦上鋪58cm厚的基質(zhì)，攤平。移栽前用0.3%高錳 酸鉀或1000倍多菌靈藥液對

12、基質(zhì)噴灑消毒。2.2移栽2.2.1移栽時間移栽最佳季節(jié)應(yīng)為日平均氣溫在1530C時，氣溫過低或過高均 不宜出瓶移栽。一般來說，在鐵皮石斛主產(chǎn)地，除了最冷的1-2月以 及最熱的7-8月外均可栽培。部分高海拔地區(qū)，除了 12月至次年3 月，其余時間均可栽培。2.2.2移栽方法用鑷子將組培苗小心取出，洗去培養(yǎng)基后，即可移植到種植畦上。 移栽時用手指在基質(zhì)挖23cm深的小洞，輕輕把石斛根部放入小洞， 注意不要弄斷石斛的肉質(zhì)根，然后用基質(zhì)蓋好。裸根苗或少根苗最好 分開種，以便于管理。移栽密度為500 株/m2，株行距為4cmX5cm。 2.3移栽后的管理2.3.1溫度管理人工移栽鐵皮石斛組培苗要滿足其冬

13、暖夏涼的要求。組培苗生長 適宜溫度為2030C。夏季溫度高時，大棚內(nèi)須通風(fēng)散熱，并常噴霧 來降溫保濕，每天噴霧35次，每次噴霧25分鐘；冬季氣溫低時， 大棚四周要密封好，以防凍傷組培苗。2.3.2濕度管理剛移栽的組培苗對水分很敏感，缺水則生長緩慢、干枯、成活率 低。而噴霧過多則漬水爛根，溫度高、濕度大時還易引發(fā)軟腐病大規(guī) 模發(fā)生。移栽后一周內(nèi)（幼苗尚未發(fā)新根）空氣濕度宜保持在90% 左右，一周后，植株開始發(fā)新根，空氣濕度可保持在70%80%。種 植畦干濕交潛有利于發(fā)根長芽。2.3.3肥水管理大棚移栽期間的施肥以葉面肥為主。由于石斛為氣生根，因此要 噴施適宜的葉面肥作為營養(yǎng)液，以供給植株充足的養(yǎng)

14、分，利早發(fā)根長 芽。葉面肥可以選擇硝酸鉀、磷酸二氫鉀、腐植酸類等，以及進口三 元復(fù)合肥和稀釋的MS培養(yǎng)基等。一般移栽后一周，植株新根發(fā)生后 開始噴施千分之一的硝酸鉀或磷酸二氫鉀，710天噴一次，連續(xù)噴3 次。長出新芽后每隔10-15天噴3%。的三元復(fù)合肥等。一般情況下， 施肥后兩天停止?jié)菜?。若空氣對流太大，則視基質(zhì)干濕度適當噴霧補 水。病蟲害防治鐵皮石斛的主要病害有軟腐病、黑斑病、炭疽病等。軟腐病發(fā) 病快，嚴重時整株腐爛解體呈濕腐狀；黑斑病危害葉片，使葉片枯萎； 石斛炭疽病危害葉片及肉質(zhì)莖，受害葉片出現(xiàn)黑色或褐色病斑。針對 這些常見病害要加強棚內(nèi)管理、注意通風(fēng)透光、適當降低棚內(nèi)濕度， 及時施藥

15、并拔出病株帶離。鐵皮石斛的主要蟲害有蝸牛、菲盾蚧、紅 蜘蛛等。其中，蝸牛是常見害蟲，危害幼莖、嫩葉、花蕾和幼果。可 用誘殺、人工捕殺或撒石灰、茶麩防治；石斛菲盾蚧寄生于植株葉片 邊緣或背面吸食汁液，可將集中有菲盾蚧的老枝燒毀或用40%樂果 乳油1 000倍等噴霧殺滅；紅蜘蛛可通過除周邊環(huán)境的雜草或噴低 毒殺螨劑8001 000倍防治。鐵皮石斛為珍貴藥材，因此鐵皮石斛 的病蟲害防治應(yīng)盡可能以預(yù)防、物理防治和生物防治為主，不用或采 用低毒農(nóng)藥；一旦發(fā)現(xiàn)有病蟲害應(yīng)及時采取相應(yīng)措施，避免病蟲害情 的加重。思考與展望有效地控制污染是植物離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。外植體造成的污染最復(fù)雜，也最難控制，其原因可能是

16、細菌引起的，也可能是真菌引起 的。微生物可能是腐生的，也可能是內(nèi)生的，最難處理的則是內(nèi)生菌。 鐵皮石斛外植體含有較多的內(nèi)生真菌，從鐵皮石斛根中分離出內(nèi)生真 菌約25種，因此鐵皮石斛的外植體消毒應(yīng)特別注意也較為困難。不 定芽誘導(dǎo)和增殖的基本培養(yǎng)基以MS為宜，同時，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 對鐵皮石斛的組織培養(yǎng)起重要作用，雖然用量小，但在植物組織培養(yǎng) 中使用的激素包括生長素、細胞分裂素等，而NAA和6-BA組合常 用于誘導(dǎo)不定芽和生根。結(jié)果與其他研究報道的鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基配方有所不同，可能與培養(yǎng)的石斛品種有關(guān)。同時，適宜的接 種密度和不同的外植體部位都會對不定芽的誘導(dǎo)和增殖產(chǎn)生一定的 影響。試驗

17、結(jié)果表明，低濃度的NAA、IBA對組培苗根系生長具有 顯著的促進作用，而高濃度的NAA、IBA均對組培苗根系生長有明 顯的抑制作用。適合鐵皮石斛組培苗生根培養(yǎng)基為：1/2 MS + 0.5mg/LNAA，其次為 1/2 MS + 0. 5 mg/L IBA。目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)的研究大多集中在快速繁殖、擴大繁殖 系數(shù)等方面，今后應(yīng)加強鐵皮石斛的基礎(chǔ)性研究，如共生菌、光照、 溫度、濕度、栽培基質(zhì)等對石斛生長發(fā)育的影響，從而深入掌握石斛 生長發(fā)育的營養(yǎng)需求，物質(zhì)合成與分解等新陳代謝規(guī)律，確定鐵皮石 斛類群生長的最佳生態(tài)環(huán)境，將研究方向和成果與大田栽培緊密結(jié)合 起來，才能從根本上解決鐵皮石斛培養(yǎng)困難，人工種植困難，產(chǎn)量低 等問題。參考文獻：張治國，劉外，王黎.鐵皮石斛原球莖增殖的培養(yǎng)條件研究J.中 草藥 23( 8) : 431.張治國，劉外，王黎，張玲.鐵皮石斛原球莖適合培養(yǎng)基研究J.中國中藥雜志1993,18 (1) :16.蔣林,丁平,鄭迎冬.添加劑對鐵皮石斛組