離子色譜法測定烏拉膽堿

1、離子色譜法測定烏拉膽堿摘要：烏拉膽堿是一種季銨鹽化合物，作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病用藥，可注射或片劑口服。本文采 用離子色譜方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的重量分析方法，簡單方便重現(xiàn)性好。不但可以同時分析烏拉膽堿 及其水解產(chǎn)物，且各項方法參數(shù)均優(yōu)于現(xiàn)有指標(biāo)，線性范圍可達(dá)4個數(shù)量級，方法準(zhǔn)確、可 靠，適于推廣。關(guān)鍵詞：離子色譜，烏拉膽堿，水解物，IonPacCS14分離柱刖曰胺類在不同的工業(yè)中廣泛應(yīng)用，如化學(xué)工業(yè)、制造業(yè)、電廠和制藥工業(yè)。在制藥工業(yè)中， 胺類能夠用于乳化劑和藥物生產(chǎn)。烏拉膽堿，2-(甲酰胺基)氧-N,N,N-三甲基丙基氯化銨， 是季銨鹽化合物，在結(jié)構(gòu)和藥效性上與乙酰膽堿有關(guān)，可注射或片劑口服用于閉尿治療。美

2、 國藥典(USP)方法24 NF 19 (第230頁)最近建議，烏拉膽堿的重量分析方法可以用選擇性更 強(qiáng)的離子色譜分析方法代替1。這個方法用IonPacCS14分離柱分離，手動配制20 mM MSA 為淋洗液，而后抑制型電導(dǎo)檢測。本應(yīng)用注解中MSA淋洗液由EG40電解在線產(chǎn)生，使得 重現(xiàn)性非常好，而且方便，不同實驗室之間容易重復(fù)。我們討論了方法的檢測限(MDLs)、 測定過程中烏拉膽堿及其降解產(chǎn)物(2-羥基三甲基丙基氯化銨，2-HPTA)的潛在干擾。實驗部分Dionex DX 600，包括：GP50梯度泵、ED50A電化學(xué)檢測器、EG40淋洗液發(fā)生器、 EluGen.EGC-MSA罐、AS50

3、自動進(jìn)樣器、AS50柱溫箱帶電導(dǎo)池Chromeleon.6.4色譜工作 站。試劑和標(biāo)準(zhǔn)17.8 MQ cm去離子水、六種陽離子混標(biāo)溶液-II、氯化烏拉膽堿(U.S. Pharmacopeia)條件分析柱：IonPac CS14陽離子交換柱 4 mm x 250 mm保護(hù)柱：IonPac CG14陽離子交換柱， 4 mm x 50 mm柱溫：30 C淋洗液：20 mM MSA，通過EG40產(chǎn)生流速：1 mL/min進(jìn)樣體積：25p檢測器：抑制型電導(dǎo)檢測，CAES.抑制器，抑制電流為67 mA預(yù)計反壓：2100 psi預(yù)計背景：0.2 p S運行時間：15 min溶液和試劑的準(zhǔn)備試劑水水的電阻率應(yīng)

4、在17.8 MQ cm以上，用前過0.2-p m膜。淋洗液向EG40 (帶EGC-MSA罐)泵入水，在線產(chǎn)生20 mM MSA淋洗液。Chromeleon軟件 能夠追蹤MSA的使用量并計算剩余的使用時間。當(dāng)剩余的使用時間降至10%以下后，更換 EGC-MSA罐。也可以手動配制20 mM MSA淋洗液。取50 mL 0.4 N MSA濃林洗液，用去 離子水稀釋至1.0 L。超聲脫氣10min。將淋洗液保存在塑料容器中?；蛘叻Q取96.10 g MSA 固體(MSA, 99%)，用500mL去離子水溶解配制成1.0 N的存儲溶液。取20 mL 1 N MSA 濃林洗液，用去離子水稀釋至1.0 L。超

5、聲脫氣10min。將淋洗液保存在塑料容器中。標(biāo)準(zhǔn)存儲液1000 mg/L烏拉膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取0.050 g烏拉膽堿固體，溶于50.0 g去離子水，保存在塑料瓶中，超聲溶解混勻。1000 mg/L 2-HPTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取0.050 g烏拉膽堿固體，溶于50.0 g去離子水，保存在塑料瓶中。加入50 mL 0.1 N NaOH，超聲溶解混勻。五天后烏拉膽堿會完全水解生成2-HPTAo標(biāo)準(zhǔn)工作液用去離子水將存儲溶液稀釋相應(yīng)倍數(shù)，得到不同濃度的工作溶液：0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 200, 500, and 1000 m

6、g/L。2-HPTA 的最高濃度為 500 mg/Lo系統(tǒng)的準(zhǔn)備和建立CAES抑制器的水化：在“Eluent-In”和“Regen-In” 口各注入3mL去離子水，約放置 20mi后，抑制器可以完全水化。要了解CAES操作的更多信息，請參考Installation and Troubleshooting Instructions for the CAES (Document No. 031770-02),安裝EG40,連接入網(wǎng)絡(luò)，用Chromeleon色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行配置。參考EG40操作手冊 調(diào)節(jié)EluGen MSA罐，以1.0 mL/min流速運行梯度，前20 min將MSA的濃度從1改變

7、到 60 mN，然后以60 mN運行40 min。在EluGen罐調(diào)節(jié)期間，去掉安裝的0.005 in. PEEK反 壓管。安裝4 X 50 mm IonPac CG14保護(hù)柱和4 X 250 mm IonPac CS14分析柱。確保系 統(tǒng)反壓大于2000 psi (20 mM MSA，1.0 mL/min)，因為EG40上安裝的高壓脫氣管要求至 少2000 psi (14 MPa)的反壓以有效除去淋洗液中的氫氣。如果必要，則安裝EG40備件箱里 的反壓管使系統(tǒng)反壓在20002800 psi。因為系統(tǒng)反壓會隨時間而增大，有必要經(jīng)常割短反 壓管以保證系統(tǒng)反壓在3000 psi以下。不要超過300

8、0 psi壓力工作。以20 mM MSA，1.0 mL/min平衡CS14柱60 min。分析前，用去離子水作系統(tǒng)空白。配制500倍稀釋的六種陽 離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，25-p L滿環(huán)進(jìn)樣。然后，配制5 mg/L烏拉膽堿和2-HPTA的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，25-p L滿環(huán)進(jìn)樣。如果兩次 進(jìn)樣的保留時間重現(xiàn)，說明系統(tǒng)已經(jīng)平衡。峰面積的精密度和準(zhǔn)確度與自動進(jìn)樣器的性能有關(guān)。每天更換沖洗容器中的水，用新鮮 過濾和脫氣的去離子水。每天檢查AS50，看樣品注射器和管路中有無氣泡。AS50的精密 度和準(zhǔn)確度與進(jìn)樣模式有關(guān)。最準(zhǔn)確的進(jìn)樣方式為滿環(huán)進(jìn)樣。為了節(jié)省溶液，可以部分環(huán)進(jìn) 樣。結(jié)果與討論在堿性溶液中，烏拉膽堿可以水

9、解成2-HPTA。本應(yīng)用注解中，在烏拉膽堿溶液中加入 0.1 N NaOH，放置五天后可生成其水解產(chǎn)物。圖1是第一天和第五天，9.5 mg/L烏拉膽堿水 解成2-HPTA的色譜圖。為了測試系統(tǒng)對烏拉膽堿及其降解產(chǎn)物2-HPTA的適用性，我們同 時測定了六種常見陽離子，如圖2所示。USP方法報道的Na+, Mg2+, Ca2+, 2-HPTA和烏拉 膽堿的相對保留時間分別為1.0, 1.4, 1.6, 2.0和2.8。本應(yīng)用注解中則分別為1.0, 1.3, 1.5, 2.0 和2.9。根據(jù)參考文獻(xiàn)1，鈣離子和2-HPTA的分辨率應(yīng)大于2,烏拉膽堿的峰效應(yīng)大于350 理論塔板數(shù)，峰的拖尾因子應(yīng)小于

10、4.5。本應(yīng)用注解的相應(yīng)值如圖2所示分別為4.66, 2189 和 1.29。表1總結(jié)了烏拉膽堿和2-HPTA的線性范圍和檢測限。校正曲線的線性范圍為四個數(shù)量 級，線性相關(guān)系數(shù)分別為2-HPTA 1.0000，烏拉膽堿0.9999。一天內(nèi)七次進(jìn)樣的重現(xiàn)性為 0.31%，四天內(nèi)88次對不同濃度的溶液進(jìn)樣，保留時間的RSD為1.6%。保留時間的重現(xiàn)性 主要由于EG40在線產(chǎn)生的MSA淋洗液純度高。與手動配制淋洗液相比，EG40自動化程 度高，操作誤差小，精密度高。F卯嶺L Z-HFIA 9 & TOLL 快th澗echo ir-/m1.2-HPT41.1 mg4雋山MS 95Figurel.Con

11、version of Bethanechol to 2-HPTA in the presence of NaOH.C AhmikiPm (GH ur) C-詢E偵時20 HIM MSAEluent 頃捉:EG40rl-f rfi? IFF W Rrlt敦1 rriL 加 inlg Volurec1Mecliixi:冷叩pre堅td crndudivi 1 CAESSample Prep:Pi叩由訕 hi Q 1 N HaOHColumn: Eljent:11 hh : ; jr-?： lemperaiure: FI av Ra(t: Irj. VolurnsDMKtion：如 CGI 4 如。

12、$1420 mM MSAEG4050 FI ml ruin2511supcr 瞄 E conductivity, caes1 LithiumZ Sodo & Amnxjnium 4 Pchssium 5. Maggum 權(quán) Calcium L2-HPTA fi. lhi)npKlreals：1 j fiy,F七TIIIil0* c, FS.*J7 51*JI)1蕓EMi lUlm* Hie MDLs were calculated as MDL- x (S) Where t - Student s rvalue for a 99% confldme level and a standard d

13、eviation estimate with n -1 degrees of freedom (t - 3.14 for seven replicates oftfie MDL Standard) and S - standard deviation of the replicate anafysis.Figure 2. Separation of Bethanechol and 2-HPTA from common morganic canons using the lonPac CSI4l?.O12-HPTA0.02-5001.00000.0060.02CationBethanechol0.02-10000.9999Linearity (r2)Ca tculated MDL* (mg/L)MDL Standard (mg/L)Table 1. Linear Range and MDLs for Bethanechol and 2-HPTA小結(jié)本應(yīng)用注解討論了用IonPacCS14分離柱分離(20 mM MSA為淋洗液)抑制性電導(dǎo)檢 測烏拉膽堿和2-HPTA的方法。這兩種在制藥上有重要意義的胺可以與可能被用作非活性成 分的常見陽離子分離。由于使用EG40在線產(chǎn)生MSA淋洗液，這兩種化合物保留時間的天 重現(xiàn)性非常好。附錄USP的方法50-p L進(jìn)樣可測定濃度高達(dá)1