產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測定

1、Word資料產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測定CENTRALSOUTHUNIVERSITY本科開放項(xiàng)目題目：學(xué)生姓名：指導(dǎo)教師：學(xué)院：專業(yè)班級：2016年3月產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其酶活的測定摘要纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是高等植物細(xì)胞壁的主要成分，是公認(rèn)的自然界數(shù)量最豐富、最廉價(jià)的可再生有機(jī)物質(zhì)資源。據(jù)估計(jì)，纖維素生成量每年高達(dá)1000億噸。我國每年農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量為7億噸左右，僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘?jiān)ㄈ绲静?、玉米秸、麥秸等），每年就?億噸之多。纖維素的降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。但由于纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對纖維素的利用仍然非常有限。目前僅有20%的纖維素物質(zhì)被開發(fā)利

2、用，大量的纖維素物質(zhì)因無法分解利用而廢棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。隨著人口數(shù)量的不斷增長和人民生活水平的不斷提高，能源危機(jī)、食物短缺、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重，尋找利用可再生資源、節(jié)省糧食、減少環(huán)境污染的有效途徑顯得日趨重要。采用微生物技術(shù)處理秸稈是當(dāng)前研究最多的一種秸稈處理方法,纖維素酶能將天然纖維素降解,生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖,然而目前制約纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素之一是纖維素酶效率低下,從而造成生產(chǎn)成本過高。因此,篩選具有高活性纖維素酶的秸稈降解微生物菌株以及相關(guān)研究是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。關(guān)鍵詞：纖維素降解高活性纖維素酶微生物菌株目錄TOC o 1-5

3、 h z HYPERLINK l bookmark6 第1章緒論1實(shí)驗(yàn)原理1實(shí)驗(yàn)儀器及試劑2實(shí)驗(yàn)材料2實(shí)驗(yàn)儀器2培養(yǎng)基2 HYPERLINK l bookmark8 第2章實(shí)驗(yàn)步驟3采樣培養(yǎng)3初篩4復(fù)篩4酶活的測定42.4.1原理42.4.2溶液配制42.4.3實(shí)驗(yàn)步驟5 HYPERLINK l bookmark10 第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果73.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制7菌株復(fù)篩結(jié)果8測定纖維素酶活力結(jié)果9 HYPERLINK l bookmark12 結(jié)束語10 HYPERLINK l bookmark14 參考文獻(xiàn)11第1章緒論實(shí)驗(yàn)原理自然界中存在大量的纖維素類物質(zhì)，同時(shí)存在著很多能分解纖維素類物質(zhì)的生物

4、，小到細(xì)菌、放線菌、真菌，大到一些食草類昆蟲與動物。這些生物與綠色植物一起構(gòu)成了這個(gè)世界的碳循環(huán)。在發(fā)酵堆肥中，存在著大量的，耐高溫的纖維素分解菌株，但多半都為混合分解，菌種需要：內(nèi)切型葡萄糖苷酶(endo-1,4-B-D-glucanase,EC3.3.1.4，簡稱EBG)，也稱Cx酶、CMC酶、EG。這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)識別并水解P-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素；外切型葡萄糖苷酶(exo-1,4-B-D-glucanase,EC321.91)，也稱C1酶、微晶纖維素酶、纖維二糖水解酶(Cellobiohydrolase簡稱C

5、BH),這類酶從纖維素長鏈的非還原性末端水解P-1,4-糖苷鍵，每次切下纖維二糖分子；B-葡萄糖苷酶(p-glucosidase,EC3.2.21，簡稱BG)又稱纖維二糖酶，它能水解纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖生產(chǎn)葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解很快。隨著葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，這種酶的專一性比較差。只有三種酶的協(xié)同作用，才能較好的分解纖維素。就單菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的總體酶活性較高，產(chǎn)量大，故在畜牧業(yè)和飼料工業(yè)中的應(yīng)用的纖維素酶主要是真菌纖維素酶。本實(shí)驗(yàn)以羥甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基，只有能夠水解纖維素成單糖并加以利用的微生物才能在篩選培養(yǎng)基上生長，利用

6、篩選培養(yǎng)基分離產(chǎn)纖維素酶的微生物。以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為唯一碳源，通過微生物分解利用CMC-Na,分離出能產(chǎn)纖維素酶的菌種；剛果紅是一種酸性染料，可與纖維素反應(yīng)形成紅色復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)儀器及試劑實(shí)驗(yàn)材料土樣取自湖南省長沙市岳麓山上、中南大學(xué)校本部草地15一20cm深處；實(shí)驗(yàn)儀器試管、燒杯、移液管、平板、錐形瓶、玻璃珠、電磁爐、電子稱、量筒、培養(yǎng)皿、酒精燈、移液槍、接種環(huán)、高壓滅菌鍋等；培養(yǎng)基（1）培養(yǎng)基A、纖維素富集培養(yǎng)基（1L）：NaCI6g,MgSO40.1g,KH2PO40.5g,CaCl20.1g,（NH4）SO42.0g,K2HPO42.0g，瓊脂1.5%,CMC-Na0.5

7、%,pH調(diào)至7.0。B、纖維素篩選培養(yǎng)基（1L）：在上述纖維素酶富集培養(yǎng)基中加入酵母粉1goC、馬丁培養(yǎng)基：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g,KH2PO43H2O0.1g,MgSO47H2O0.05g,0.1%孟加拉紅溶液0.33mL，瓊脂1.5g，蒸餾水100mL,自然ph,2%去氧膽酸鈉溶液2mL（預(yù)先滅菌臨用前加入）,，-鏈霉素溶液10000u/mL0.33mL（臨用前加入）。（2）溶液A、剛果紅染色液：用蒸餾水溶解剛果紅，終濃度為0.1%（w/v）oB、剛果紅脫色液:終濃度為1mol/L的NaCl溶液。第2章實(shí)驗(yàn)步驟采樣培養(yǎng)采樣：在事先勘察好的取樣地土壤15-20cm，取3個(gè)點(diǎn)采樣；溶解：將

8、3份土樣各10g加入帶有玻璃珠的錐形瓶并溶于無菌水中，在搖床上以200r/min振蕩30min；富集：配制100mL富集培養(yǎng)基中，加入250mL錐形瓶中，取生理鹽水中振蕩的土樣溶液上清取5mL加入富集培養(yǎng)基中，30U20Or/min,培養(yǎng)24h；稀釋：梯度稀釋10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L、10-4mol/L,10-5mol/L、10-6mol/L。初篩初篩：選取10-5mol/L、10-6mol/L兩個(gè)濃度梯度各O.ImL分別做3個(gè)平行，涂布于纖維素富集培養(yǎng)基平板上，30C。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。挑取生長良好的形態(tài)大小不同的菌落于纖維素液體富集培養(yǎng)基中30C200

9、r/min,培養(yǎng)24h。復(fù)篩復(fù)篩：用接種針將分離到的菌株活化后點(diǎn)種于纖維素篩選培養(yǎng)基平板上,30C。恒溫倒置培養(yǎng)2d。用0.1%剛果紅染色液浸染再用1mol/LNaCI溶液脫色5mino若菌株產(chǎn)纖維素酶,則會在菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈,依據(jù)透明圈直徑與菌落直徑的比值大小選擇產(chǎn)酶菌株將篩選獲得的產(chǎn)纖維素酶的菌株接種到馬丁培養(yǎng)基中，30C培養(yǎng)4d,能在該培養(yǎng)基中生長良好的為真菌,不能生長的為細(xì)菌。酶活的測定原理纖維素經(jīng)纖維素酶水解后生成的還原糖能將3,5-二硝基水楊酸(DNS)中的硝基還原為氨基，生成棕紅色的氨基化合物。在一定的濃度范圍內(nèi),還原糖的量與棕紅色的深淺呈正比關(guān)系。可用比色法測定。溶液配

10、制(1)CMC-Na底物溶液的配制濃度1%熱水煮ph4.5Table2斗ThebulTcryutulknmdieexperinitritpll藥品黑廝加宣(g)藥品名澹iint細(xì)5N13HPO4-121107.37842.03796K3HPO43H:O0.6025KFI叫236247K：HPO43H2O2.0711.0478缶KHPOi*SH.O4.2905KHKJjD.JW39甘瓠鹼0.7507NaOH0.0704100_7507NaOH0.2560(2)DNS的配制總量為250ml配方稱取3,5-二硝基水楊酸(2.50.1g),置于約150mL水中，逐漸加入氫氧化鈉10g,在50C。水浴中

11、(磁力)攪拌溶解，在再依次加入酒石酸鉀鈉50g、苯酚(重蒸)0.5g和無水硫酸鈉1.25g,待全部溶解澄清后，冷卻至室溫，用水定容至250mL,過濾。貯存于棕色試劑瓶中，于暗處放置7d后使用。但是一定要注意,3,5-二硝基水楊酸和NaOH的加入時(shí)間一定要很近,或者是先加入NaOH。否則會產(chǎn)生難溶的沉淀，導(dǎo)致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過50攝氏度。3.200mL0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液ph4.5酶活定義1mL液體酶在指定溫度50,pH=4.5,每分鐘水解CMC-Na底物，產(chǎn)生相當(dāng)于lug葡萄糖的還原糖量，為1個(gè)酶活力單位，以ug/mL*min表示。簡寫為CMC-N

12、a。2.4.3實(shí)驗(yàn)步驟(1)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度10mg/mLA、向25mL容量瓶中按下表加入相應(yīng)體積的葡萄糖儲液。2-3標(biāo)出箭荀疇幣鞭配制農(nóng)Table2-3Tlieslanderglucoserieagent序號葡瀟嘶濃麼(mgniL)加入宿檢量000J0.51252L1.S31.53.7542552.5ft.25C37.5B、取0.5mL各個(gè)濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入3mLDNS試劑混勻，沸水浴10min后終止反應(yīng)，定容至25mL，在540nm處測定吸光度。每管取3個(gè)平行樣。C、所得平行吸光度取均值，對應(yīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，吸光度為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量為縱坐標(biāo)作圖，作線性擬合，

13、得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。空白管的測定：同DNS法，將0.5mL酶液改成0.5mL緩沖液制備粗酶液A、取發(fā)酵液1mL8000r/min常溫離心10min,取上清液為粗酶液；B、取粗酶液依次稀釋至10-1mol/L、10-2mol/L、10-3mol/L。DNS法測酶活力參照DNS法，取0.5mL稀釋后的酶液，加入到2mL的CMC-Na底物緩沖液溶液。50C。水浴反應(yīng)30min后，立即加入3mLDNS試劑混勻，沸水浴10min后終止反應(yīng)，冷卻后定容至25mL。在540nm處測定吸光度，以空白作為對照調(diào)零值，每管取三個(gè)平行樣。第3章實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2Word資料0020406OS系列1線性（

14、系列1）Word資料3.2菌株復(fù)篩結(jié)果3.3測定纖維素酶活力結(jié)果復(fù)篩之后測定酶活沒有得到預(yù)想的結(jié)果，分析原因如下：1）復(fù)篩挑選的菌株不準(zhǔn)確，培養(yǎng)得到的菌株不是產(chǎn)纖維素酶的菌株；2）取樣地點(diǎn)有限，取樣地菌落可能不符合實(shí)驗(yàn)要求；3）稀釋梯度太大，富集之后得到的菌株太少；4）操作過程中無菌不是很嚴(yán)格，可能發(fā)生了染菌。結(jié)束語地球上每年生產(chǎn)超過5000億噸的纖維素，因而纖維素是儲藏極為豐富的資源。它的生產(chǎn)對人類生存環(huán)境和可持續(xù)發(fā)展有著舉足輕重的影響。纖維素酶的微生物的發(fā)酵研究主要為菌種的選育以及工藝優(yōu)化兩方面。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的纖維素酶生產(chǎn)的研究主要集中于原料預(yù)處理和發(fā)酵過程。纖維素酶的生產(chǎn)主要存在酶活力和產(chǎn)

15、酶量不足的問題，運(yùn)用各種科學(xué)方法提高纖維素酶的活力和產(chǎn)量已成為科學(xué)研究的重要方面。當(dāng)前纖維素酶研究的一個(gè)重要課題就是選育新菌株以提高纖維素酶的產(chǎn)量和質(zhì)量從而達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。萬事開頭難，第一次實(shí)驗(yàn)報(bào)告也是如此，實(shí)驗(yàn)原理論述長，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理麻煩，課后思考題做著糾結(jié)，牢騷也發(fā)了，但還是耐著性子一項(xiàng)一項(xiàng)的完成了。慢慢地也就沒有了那種排斥感，更多的是當(dāng)做一種習(xí)慣，當(dāng)作實(shí)驗(yàn)后的一種總結(jié)把實(shí)驗(yàn)時(shí)得到的一些簡單數(shù)字變成說服人的道理。這次實(shí)驗(yàn)對我而言并不僅僅是學(xué)習(xí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法的寶貴經(jīng)歷，它意味著更多。首先是實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的完備性，從這里可以初步感受到生物學(xué)研究的科學(xué)性與嚴(yán)肅性，自己可

16、以得到寶貴的機(jī)會，親身體會生物學(xué)研究的苦辣酸甜。一直一直喜歡，得到正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)刻的暢快感，那是無法言明的欣慰感，一次身心徹底地放松，可以將所有一整天來積累的疲勞拋之身后，即使僅僅是小小的成功，也會讓我們興奮不已。失誤是常有的，經(jīng)歷過吃驚、后悔、無奈，檢討分析，最后重新開始。一波三折的記憶清晰的印在腦海中，這種深深的挫折感，再試一次的勇氣，我會一生記取的。我明白了實(shí)踐遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于理論的道理，很感謝學(xué)校老師給了我們這么好的機(jī)會，能讓我們及時(shí)地把生物課堂上學(xué)習(xí)的理論結(jié)合上實(shí)踐。我也漸漸掌握了用已學(xué)的知識去處理數(shù)據(jù)，制作合適的表格，并用自己的語言去總結(jié)。不再是高中時(shí)看老師做實(shí)驗(yàn)，被動地記錄數(shù)據(jù)，得出結(jié)論

17、。在這樣的課上，我感受到的是我們每個(gè)人都是主體，我們要靠自己課前的預(yù)習(xí)知識和基礎(chǔ)知識，要靠自己的思考和探究。因此我們學(xué)會了做好課前預(yù)習(xí)，鍛煉了思考的靈性和深度。當(dāng)然另一方面，我還深深感到自己動手能力的不足，有些實(shí)驗(yàn)做著總感覺沒別的同學(xué)來得快，可能還是練得少的緣故。孰能生巧，我相信通過不斷的練習(xí)，實(shí)驗(yàn)會進(jìn)行得更加順利。參考文獻(xiàn)1梅玉峰纖維素酶產(chǎn)生菌的選育卩吉林農(nóng)業(yè)，2005,28(1)：64-672張壯志高效纖維素分解菌的篩選、鑒定及其生長條件和產(chǎn)酶活性的研究D.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.韓立榮，張雙璽，祝傳書，張興高效纖維素降解真菌的篩選和鑒定J.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2