細(xì)胞工程花藥和花粉培養(yǎng)

1、第 7 章 花藥和花粉培養(yǎng) 西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY細(xì)胞工程細(xì)胞工程 CELL ENGINEERINGCELL ENGINEERING西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY 花粉和花藥培養(yǎng)技術(shù) 花粉和花藥培養(yǎng)應(yīng)用本章主要內(nèi)容第 7 章 花藥和花粉培養(yǎng)西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY 掌握花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的區(qū)別 了解花藥最佳接種時(shí)期 掌握花藥培養(yǎng)的大致過(guò)程 掌握花粉發(fā)育的途徑 掌握花粉培養(yǎng)的大致過(guò)程 了解花粉和花藥培養(yǎng)過(guò)程中的白化苗問(wèn)題本本章章教教學(xué)學(xué)目目的的與與要要求求西華師范大學(xué)C

2、HINA WEST NORMAL UNIVERSITY7.1 花藥培養(yǎng)1 1、花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)（anther culture )anther culture )：指的是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種在適宜的培養(yǎng)基上，使得其中的花粉發(fā)育成單倍體植株的過(guò)程。西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY2 2、花藥培養(yǎng)簡(jiǎn)史、花藥培養(yǎng)簡(jiǎn)史1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花藥培養(yǎng)獲得煙草植株；1973年：我國(guó)首次報(bào)道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株；80年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培

3、養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類(lèi)、水稻、玉米等；90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak (1999) 西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY3 3、花藥培養(yǎng)與單倍體育種、花藥培養(yǎng)與單倍體育種花藥培養(yǎng)的主要目的，是培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來(lái)源。利用雜種花藥離體培養(yǎng)獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來(lái)，具有豐富的變異類(lèi)型，選擇出有利的變異類(lèi)型，經(jīng)過(guò)經(jīng)濟(jì)性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于生產(chǎn)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。構(gòu)建永久性分離群體雙單倍體系（Doubled haploid)，用于基因定位。西華師范

4、大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY4 4、花藥培養(yǎng)主要環(huán)節(jié)：、花藥培養(yǎng)主要環(huán)節(jié)：選材：選取花粉單核期的花蕾或幼穗（例如：在水稻中，以單核靠邊期的花粉對(duì)誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5-15cm，穎片淡黃綠色、雄蕊長(zhǎng)度接近穎片長(zhǎng)度的1/2這些條件鑒定。）預(yù)處理:低溫冷藏是最常用的方法表面消毒接種：無(wú)菌條件下取出花藥接種并培養(yǎng)形成花粉植株：花粉胚或花粉愈傷組織發(fā)育到適當(dāng)階段后，轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中生成花粉植株移栽：煉苗后移入土壤栽西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY5 5、水稻花藥培養(yǎng)過(guò)程、水稻花藥培養(yǎng)過(guò)程旗葉鞘用70酒精擦

5、洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗10漂白粉10 min無(wú)菌水洗3次培養(yǎng)5天，花藥變褐，20天后花藥裂開(kāi)，長(zhǎng)出淡黃色的花粉愈傷組織，先長(zhǎng)芽，后長(zhǎng)根，形成幼苗。用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上左手持穗，右手用鑷子取花藥，放無(wú)菌培養(yǎng)皿中西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY附：水稻花藥培養(yǎng)過(guò)程附：水稻花藥培養(yǎng)過(guò)程部分花藥產(chǎn)生愈傷組織部分花藥產(chǎn)生愈傷組織愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株愈傷組織分化形成再生植株接種在平板上的水稻花藥接種在平板上的水稻花藥西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY6 6、影響花粉植株誘導(dǎo)率

6、的因素：、影響花粉植株誘導(dǎo)率的因素：供體植株基因型：供體植株基因型：不同植物甚至不同品種之間對(duì)花藥培養(yǎng)的反應(yīng)都有差異。因此選擇合適的品種是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵供體植株的生理供體植株的生理狀態(tài)：狀態(tài)：如多年生植物中，幼年植株比老年植株的花藥誘導(dǎo)頻率高花藥的發(fā)育時(shí)期：花藥的發(fā)育時(shí)期：在誘導(dǎo)花粉進(jìn)行雄性發(fā)育(指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株)過(guò)程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時(shí)期不同。對(duì)多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，單核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織?；ㄋ幑w植株的生長(zhǎng)條件：花藥供體植株的生長(zhǎng)條件：水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提高。同步化程度高。西華師范大學(xué)CH

7、INA WEST NORMAL UNIVERSITY7 7、培養(yǎng)基培養(yǎng)基在花藥培養(yǎng)中的重要作用：在花藥培養(yǎng)中的重要作用：我國(guó)科學(xué)工作者對(duì)水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進(jìn)，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培養(yǎng)基的特點(diǎn)是銨離子濃度較低。隨后，進(jìn)一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時(shí)附加生物素，研制出C17和W14培養(yǎng)基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。 MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng) B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng) N6培養(yǎng)基：適合禾谷類(lèi)作物的花藥培養(yǎng)常用培養(yǎng)基西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY8 8、激素種類(lèi)和濃度激素

8、種類(lèi)和濃度在花藥培養(yǎng)中的重要作用：在花藥培養(yǎng)中的重要作用：細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成 生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)愈傷組織形成 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗9 9、蔗糖濃度蔗糖濃度在花藥培養(yǎng)中的重要作用：在花藥培養(yǎng)中的重要作用：較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織較低 濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY7.2 花粉培養(yǎng)1 1、花粉培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)（pollen culture )pollen culture )：是將花粉從花藥中分離出來(lái),接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的過(guò)程。油菜成熟花藥的結(jié)構(gòu)油菜成熟

9、花藥的結(jié)構(gòu)花粉囊花粉囊花粉囊壁花粉囊壁成熟花粉粒成熟花粉?；ㄋ幜芽诨ㄋ幜芽谖魅A師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY2 2、花粉發(fā)育時(shí)期、花粉發(fā)育時(shí)期：（適宜適宜時(shí)期：?jiǎn)魏似跁r(shí)期：?jiǎn)魏似? ,尤其是單核中、尤其是單核中、晚期晚期-單核單核靠邊期靠邊期) )雄配子體的發(fā)育雄配子體的發(fā)育 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY 花粉粒花粉粒（雄配子體）（雄配子體）形態(tài)形態(tài)2 2- -細(xì)胞細(xì)胞花粉花粉3-3-細(xì)胞細(xì)胞花粉花粉西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY草莓花藥愈傷組

10、織和花藥植株西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY選幼年樹(shù)花蕾取下花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥接種注：藥注：藥壁向花粉提供壁向花粉提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，通過(guò)通過(guò)藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)低溫預(yù)處理低溫預(yù)處理消毒消毒再生再生分離分離花粉花粉過(guò)濾過(guò)濾離心離心3 3、花粉培養(yǎng)過(guò)程：、花粉培養(yǎng)過(guò)程：西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY3 3、花粉分離和純化方法：、花粉分離和純化方法：分離方法：分離方法： 自然自然散落法散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) ：將花藥接種在預(yù)處理液或液體

11、培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。 擠壓法擠壓法：在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。 機(jī)械游離：機(jī)械游離： （1）磁攪拌法：用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來(lái)；（2）超速旋切法：通過(guò)攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來(lái)（此法應(yīng)用最廣）。小孢子純化小孢子純化 對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過(guò)篩、梯度離心處理純化小孢子西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY附：花粉分離純化的變化附：花粉分離純化的變化30%30%蔗糖梯度離心后蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）（獲得均一的小孢子群體）梯度離心前梯度離心前（小孢

12、子形態(tài)、活力不一致）（小孢子形態(tài)、活力不一致）西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY4 4、花粉培養(yǎng)方法：、花粉培養(yǎng)方法： 平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)：花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)：花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。 雙層培養(yǎng)雙層培養(yǎng)：花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。 看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)：利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)：利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。 條件條件培養(yǎng)基培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)：利用培養(yǎng)過(guò)花藥的液體培養(yǎng)基或

13、含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY附：看護(hù)培養(yǎng)圖解附：看護(hù)培養(yǎng)圖解西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY5 5、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)異同：、花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)異同：相同點(diǎn)：相同點(diǎn)：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑 不同點(diǎn)：不同點(diǎn)：花粉培養(yǎng)需進(jìn)行花粉的分離特殊的花粉誘導(dǎo)培養(yǎng)西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY6 6、單倍體植株染色體加倍的方法：、單倍體植株染色體加倍的方法：自然加倍：自然加倍：花粉細(xì)胞核有絲分裂或核融合，染色體可自然加倍，獲得純合二倍體。人工加倍：人工加倍：用秋水仙素處理單倍體植物，可使染色體加倍（溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實(shí)的二倍體植株）( (將單倍體植株誘導(dǎo)的愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，再分化可得到二倍體植株。將單倍體植株誘導(dǎo)的愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，再分化可得到二倍體植株。) )西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY7.3 花藥和花粉培養(yǎng)中的白化苗問(wèn)題圖示：白化苗現(xiàn)象圖示：白化苗現(xiàn)象西華師范大學(xué)CHINA WEST NORMAL UNIVERSITY1 1、白化、白化苗產(chǎn)生的影