聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第一頁，共26頁。一、一、PCRPCR的定義的定義 在引物指導(dǎo)下由酶催化的在引物指導(dǎo)下由酶催化的對(duì)特定克隆或基因組對(duì)特定克隆或基因組DNADNA序列序列進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。進(jìn)行的體外擴(kuò)增反應(yīng)。第二頁，共26頁。 第三頁，共26頁。第四頁，共26頁。二、二、PCRPCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等好、易自動(dòng)化等 能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNADNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍第五頁，共26頁。三、三、PC

2、RPCR原理原理Sample1. denaturatation2. Primer annealing3. Primer extensionRegion to be copied第六頁，共26頁。PCRPCR技術(shù)原理技術(shù)原理類似于類似于DNADNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物?；パa(bǔ)的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA變性：變性：加熱至加熱至9494左右，雙鏈左右，雙鏈DNADNA解離成單鏈；解離成單鏈；模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性) )：5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單單

3、鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：引物的延伸：在在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP為原料，靶為原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的雙鏈；條新的雙鏈；重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)變性變性-退火退火-延伸延伸三過程，使三過程，使DNADNA擴(kuò)增量呈指數(shù)擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。上升。 第七頁，共26頁。目錄目錄n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C第八頁，共26頁。1234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR的基本原理適溫

4、延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第九頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95第十頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物第十一頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PC

5、R的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第十二頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始第十三頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaq第十四頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束第十五頁，共26頁。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增第十六頁，共26頁。PCR productPCR product第十七頁，共26頁。Target Amplif

6、icationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon第十八頁，共26頁。PCR儀第十九頁，共26頁。四、四、PCRPCR的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 10l

7、4種種dNTP混合物混合物 各各200mol/L 引物引物 10100 pmol 模板模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5 ul （Mg2+） 1.5 mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ulHomeHome第二十頁，共26頁。五、五、PCRPCR反應(yīng)五要素反應(yīng)五要素引物引物 （primerprimer）酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase） dNTP dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （templatetemplate） MgMg2+ 2+ （m

8、agnesiummagnesium）第二十一頁，共26頁。六、PCR的類型及應(yīng)用1、 PCR的類型反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)：RNA的反轉(zhuǎn)錄與PCR的聯(lián)合應(yīng)用原位PCR技術(shù)：在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，不需要提取DNA實(shí)時(shí)PCR技術(shù)：進(jìn)行DNA的定量分析筑巢筑巢PCR PCR 彩色彩色PCR PCR 多重多重PCR PCR 不對(duì)稱不對(duì)稱PCR PCR 共享引物共享引物PCR PCR 差異顯示差異顯示PCR PCR 錨定錨定PCR PCR 重組重組PCRPCR第二十二頁，共26頁。2、 PCR的應(yīng)用 研究 -基因克隆、測序、分析突變 診斷 -細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測、診斷 人類基因組工程 -遺傳圖譜的構(gòu)建、測序、表達(dá)圖譜 法醫(yī) -犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 腫瘤檢測 其他第二十三頁，共26頁。法醫(yī)學(xué)法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別、親子鑒定1985年，英國遺傳學(xué)家Jeffreys采用DNA指紋圖譜進(jìn)行個(gè)人識(shí)別和親子鑒定。有時(shí)犯罪物證量很少，不足以用來進(jìn)行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對(duì)于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學(xué)上認(rèn)證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。第二十四頁，共26頁。什么是“DNA指紋技術(shù)”？ 世界上除同卵雙生外，幾