微量克氏定氮法定量測定蛋白質含量ppt課件

1、微量克氏定氮法測定蛋白質含量微量克氏定氮法測定蛋白質含量一、實驗目的一、實驗目的l掌握微量克氏定氮法定量測定蛋白質含量的原理掌握微量克氏定氮法定量測定蛋白質含量的原理和操作技術。和操作技術。 二、實驗原理二、實驗原理l天然含氮有機化合物如蛋白質與濃硫酸共熱時分天然含氮有機化合物如蛋白質與濃硫酸共熱時分解出氨，氨與硫酸反響生成硫酸銨。在克氏定氮儀中解出氨，氨與硫酸反響生成硫酸銨。在克氏定氮儀中參與強堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣參與強堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中，然后再用規(guī)范酸溶液蒸餾法將氨蒸入無機酸溶液中，然后再用規(guī)范酸溶液進展滴定，滴定所用無機

2、酸的量進展滴定，滴定所用無機酸的量molmol相當于被測相當于被測樣品中氨的量樣品中氨的量molmol，根據(jù)所測得的氨量即可計算，根據(jù)所測得的氨量即可計算樣品的含氮量。樣品的含氮量。 l由于蛋白質含氮量通常在由于蛋白質含氮量通常在16%16%左右，所以將克氏定左右，所以將克氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)氮法測得的含氮量乘上系數(shù)6.256.25，便得到該樣品，便得到該樣品的蛋白質含量。的蛋白質含量。 l 整個反響過程可分為消化、蒸餾及滴定三大步整個反響過程可分為消化、蒸餾及滴定三大步驟。驟。 l 樣品與濃硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳和樣品與濃硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳和水，氮轉變出的氨，進一

3、步與硫酸作用生成硫酸水，氮轉變出的氨，進一步與硫酸作用生成硫酸銨，此過程通常稱之為銨，此過程通常稱之為“消化。消化。 l但是，這個反響進展得比較緩慢，通常需求參與硫酸鉀或但是，這個反響進展得比較緩慢，通常需求參與硫酸鉀或硫酸鈉以提高反響液的沸點，并參與硫酸銅作為催化劑，硫酸鈉以提高反響液的沸點，并參與硫酸銅作為催化劑，以加快反響速度。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：以加快反響速度。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下： l CH3NH2COOH + 3H2SO4 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + CH3NH2COOH + 3H2SO4 3CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3

4、 NH3 1 1l 2NH3 + H2SO4 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4(NH4)2SO4 2 2l (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 2NH3 3 3l l 反響反響1 1、2 2在克氏定氮燒瓶中完成。反響在克氏定氮燒瓶中完成。反響3 3在克氏定氮儀內進展。在克氏定氮儀內進展。 l濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸氣將濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸氣將產生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液中，氨與溶液中產生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液

5、中，氨與溶液中的氫離子結合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然的氫離子結合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用規(guī)范無機酸滴定至恢復溶液中原來氫離子濃度為止。后用規(guī)范無機酸滴定至恢復溶液中原來氫離子濃度為止。最后根據(jù)所用規(guī)范酸的摩爾數(shù)計算出待測物中的總氮量。最后根據(jù)所用規(guī)范酸的摩爾數(shù)計算出待測物中的總氮量。 三、實驗器材l1 1微量克氏定氮儀：參見圖微量克氏定氮儀：參見圖5-15-1，1 1套套/ /組。組。l2 2克氏定氮燒瓶：克氏定氮燒瓶：2 2只只/ /組。組。 3取樣器：，5mL、1 mL各1只/組。 運用指南：接好套頭不漏氣經(jīng)過旋鈕調理容量如500表示5mL用活塞第一擋吸液用活

6、塞第一擋和第二擋放液換套頭繼續(xù)運用。留意，平常取樣器應掛在架子上，絕不可倒置，以免溶液倒流入槍體中而損壞儀器。 4電爐：公用。 51微量滴定管5 mL：1只/2組。 6酒精燈：1只/組。 7錐形瓶100 mL：4只/組。 8鐵架臺、十字夾、龍爪、打火機、外表皿、吸管、量筒等。 五、實驗操作五、實驗操作l. .消化：將兩個消化：將兩個50mL50mL的克氏定氮燒瓶編號在燒瓶的克氏定氮燒瓶編號在燒瓶口附近，一只燒瓶內加口附近，一只燒瓶內加1.0mL1.0mL蒸餾水，作為空白。蒸餾水，作為空白。另一只燒瓶內參與另一只燒瓶內參與1.0mL1.0mL樣液卵清蛋白液。然后樣液卵清蛋白液。然后用取樣器各加濃

7、硫酸用取樣器各加濃硫酸2mL2mL取濃硫酸時勿濺到衣物和取濃硫酸時勿濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實驗桌上，用藥勺加硫酸鉀皮膚上，也不要灑到實驗桌上，用藥勺加硫酸鉀硫酸銅混合物約硫酸銅混合物約20mg20mg不用稱重，一點點即可，一不用稱重，一點點即可，一切試劑要盡量加到克氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上切試劑要盡量加到克氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上小漏斗作冷凝用，燒瓶置通風櫥內的電爐上加熱小漏斗作冷凝用，燒瓶置通風櫥內的電爐上加熱消化，參見圖消化，參見圖5-35-3，留意先啟動抽風機。消化時間為，留意先啟動抽風機。消化時間為2 24h4h。在消化時可以同時進展第二步。在消化時可以同時進展第二步。

8、消化安裝l. .蒸餾：取蒸餾：取100mL100mL錐形瓶錐形瓶3 3只，洗滌干凈，用取樣器各參只，洗滌干凈，用取樣器各參與與2%2%硼酸溶液硼酸溶液5.0mL5.0mL，參與幾滴指示劑，溶液顯紫色，用，參與幾滴指示劑，溶液顯紫色，用l外表皿蓋好備用。如錐形瓶內液體呈綠色，需重新洗滌。外表皿蓋好備用。如錐形瓶內液體呈綠色，需重新洗滌。 l安裝好微量克氏定氮儀。微量克氏定氮儀實踐上是一套蒸安裝好微量克氏定氮儀。微量克氏定氮儀實踐上是一套蒸餾安裝，留意保證每個夾子夾緊而不漏氣，保證加樣口餾安裝，留意保證每個夾子夾緊而不漏氣，保證加樣口的小漏斗口朝上并斜靠在定氮儀上這可以經(jīng)過調整其下的小漏斗口朝上并

9、斜靠在定氮儀上這可以經(jīng)過調整其下方夾子的方位來實現(xiàn)。方夾子的方位來實現(xiàn)。 la)a)蒸餾瓶的洗滌蒸餾瓶的洗滌l l參見圖參見圖5-65-6，將自來水由，將自來水由5 5經(jīng)經(jīng)7 7注入到蒸餾瓶夾層注入到蒸餾瓶夾層2 2即蒸汽即蒸汽發(fā)生室中，使水面到達蒸餾瓶頸部的轉彎處。把裝有蒸發(fā)生室中，使水面到達蒸餾瓶頸部的轉彎處。把裝有蒸餾水的錐形瓶餾水的錐形瓶9 9置于冷凝器置于冷凝器4 4下方，并將冷凝器下方的導管下方，并將冷凝器下方的導管1212下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗3 3注注入到蒸餾瓶的反響室入到蒸餾瓶的反響室1 1中，把一切夾子夾緊，

10、翻開冷凝水。中，把一切夾子夾緊，翻開冷凝水。用酒精燈用酒精燈1111將蒸餾瓶夾層將蒸餾瓶夾層2 2內的水煮沸，然后移去火源，內的水煮沸，然后移去火源，錐形瓶錐形瓶9 9中的蒸餾水就會從冷凝器下方的導管中的蒸餾水就會從冷凝器下方的導管 12 12倒流到蒸倒流到蒸餾瓶的反響室餾瓶的反響室1 1內，再倒流至蒸餾瓶的夾層內，再倒流至蒸餾瓶的夾層2 2中，由廢液排中，由廢液排出口出口8 8排出。按照上述方法將儀器洗滌排出。按照上述方法將儀器洗滌2 23 3次。最后，反次。最后，反響室響室1 1中的余液可以按下法清空：把一切夾子夾緊，將蒸中的余液可以按下法清空：把一切夾子夾緊，將蒸餾瓶夾層餾瓶夾層2 2內

11、的水煮沸，先移去錐形瓶內的水煮沸，先移去錐形瓶9 9，然后移去火源，然后移去火源，反響室反響室1 1中余液將倒流至夾層中余液將倒流至夾層2 2中，由中，由7 7排出。以后每次在排出。以后每次在做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌2 23 3次，并將反響次，并將反響室室1 1清空。清空。lb)b)空白和樣品的蒸餾空白和樣品的蒸餾 l 把裝有把裝有5.0mL5.0mL的的2%2%硼酸溶液的錐形瓶硼酸溶液的錐形瓶9 9置于冷凝器的下方，將冷凝置于冷凝器的下方，將冷凝器下方的導管器下方的導管1212下端插入液面以下，錐形瓶內須事先參與指示劑下端插入液面以下，錐形瓶內須事

12、先參與指示劑留意此時的顏色，它將是后面滴定終點的顏色。先將克氏燒瓶留意此時的顏色，它將是后面滴定終點的顏色。先將克氏燒瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗中消化好了的空白消化液由小漏斗3 3注入到蒸餾瓶的反響室注入到蒸餾瓶的反響室1 1中，用中，用蒸餾水洗滌克氏燒瓶蒸餾水洗滌克氏燒瓶2 2次每次約次每次約2mL2mL，洗滌液皆由漏斗，洗滌液皆由漏斗3 3注入反響注入反響室室1 1。用取樣器取。用取樣器取40%40%氫氧化鈉溶液氫氧化鈉溶液10mL10mL，注入小漏斗小漏斗必需，注入小漏斗小漏斗必需一直堅持口朝上的形狀，放松夾子，使其漸漸流入反響室一直堅持口朝上的形狀，放松夾子，使其漸漸流入反響室1

13、 1。當小。當小漏斗內仍有少量漏斗內仍有少量NaOHNaOH溶液時，立刻夾緊夾子以上操作勿將溶液時，立刻夾緊夾子以上操作勿將NaOHNaOH溶溶液濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實驗桌上。再加約液濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實驗桌上。再加約3mL3mL蒸餾水于蒸餾水于小漏斗內，同樣漸漸放入反響室，并留少量水在漏斗內作水封。把小漏斗內，同樣漸漸放入反響室，并留少量水在漏斗內作水封。把一切夾子夾緊，翻開冷凝水，開場用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層一切夾子夾緊，翻開冷凝水，開場用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層2 2內內的水煮沸。留意，在樣品蒸餾的整個過程中，要堅持火苗的穩(wěn)定，的水煮沸。留意，在樣品蒸餾的整個過程中，

14、要堅持火苗的穩(wěn)定，嚴禁中途移去火源，以防倒吸。從蒸餾瓶內的水溶液沸騰開場計算嚴禁中途移去火源，以防倒吸。從蒸餾瓶內的水溶液沸騰開場計算時間，大約時間，大約10min10min即可蒸餾終了。將導管即可蒸餾終了。將導管1212的下端抽出液面，繼續(xù)蒸的下端抽出液面，繼續(xù)蒸餾餾1min1min，使導管內的余液落回錐形瓶，使導管內的余液落回錐形瓶9 9中，移開錐形瓶，用外表皿蓋中，移開錐形瓶，用外表皿蓋好等待滴定。移去火源，反響室好等待滴定。移去火源，反響室1 1中的殘液將會倒流至夾層中的殘液將會倒流至夾層2 2中，由中，由8 8排出。將蒸餾瓶洗滌排出。將蒸餾瓶洗滌2 23 3次，并將反響室次，并將反響

15、室1 1清空，按空白蒸餾的方法清空，按空白蒸餾的方法進展樣品蒸餾。進展樣品蒸餾。 改良式微量克氏定氮儀各部表示圖 l. .滴定：參見圖滴定：參見圖5-65-6，將微量，將微量滴定管先后用蒸餾水和滴定管先后用蒸餾水和0.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液潤洗，用溶液潤洗，用洗耳球將洗耳球將0.01mol/L0.01mol/L的的HClHCl溶液溶液吸入微量滴定管中，滴定錐形吸入微量滴定管中，滴定錐形瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色瓶中的硼酸液至呈淡葡萄紫色也就是前面加了指示劑后的也就是前面加了指示劑后的規(guī)范硼酸溶液的顏色。記錄規(guī)范硼酸溶液的顏色。記錄所耗所耗HClHCl溶液毫升數(shù)。溶液毫升數(shù)。 l. .再次將蒸餾瓶洗滌干凈，裝配克氏定氮儀安裝，清洗再次將蒸餾瓶洗滌干凈，裝配克氏定氮儀安裝，清洗所運用過的一切玻璃儀器，清洗取樣器套頭，整理好桌面所運用過的一切玻璃儀器，清洗取樣器套頭，整理好桌面上的儀器和試劑，并留意清潔本人的操作臺，請教師驗收，上的儀器和試劑