腸道致病菌的分離與鑒定

1、腸道致病菌的分離與鑒定1、 實驗?zāi)康模?）掌握腸道致病菌的分離、鑒定的主要步驟（2）掌握平板劃線分離法（3）掌握玻片凝集試驗的操作方法以及實際意義2、 實驗材料（1）實驗儀器：試管、玻片、酒精燈、接種針、接種環(huán)、試管架、（2）實驗試劑：生理鹽水、細(xì)菌培育基、傷寒診斷血清、伊紅美藍(lán)培育基（EMB）、克氏雙糖鐵培育基（KIA）、葡萄糖發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、尿素培育基、蛋白胨水、半固體培育基3、 實驗流程 （1）腸道致病菌的分離 待測標(biāo)本的制作：把接種環(huán)放置于點燃的酒精燈火焰處對其進(jìn)行滅菌，用已滅菌的接種環(huán)在細(xì)菌培育基中取少量待測細(xì)菌于盛有5ml生理鹽水的試管中，混勻。 細(xì)菌的分離接種：

2、用接種環(huán)取適量配置好的細(xì)菌懸液，在酒精燈四周進(jìn)行劃線分離法接種細(xì)菌于EMB培育基。將培育基置于37培育1824小時。（2）腸道致病菌的純化 單菌落接種：從已培育待測細(xì)菌的EMB培育基上用已滅菌的接種針挑取某單個菌落接種到KIA培育基上，一部分直接深化培育基中底部，一部分直接涂抹于斜面處，置于37培育1824小時。 待測細(xì)菌的初步推斷：取出已純化培育待測細(xì)菌的KIA培育基，觀察現(xiàn)象，初步斷定該細(xì)菌是致病菌或是非致病菌。（3）腸道致病菌的鑒定 生化鑒定：分別取葡萄糖、乳糖、甘露醇發(fā)酵管各一只（注意管內(nèi)的小倒管則應(yīng)布滿液體，不含氣泡），用已滅菌的接種針取已培育的KIA培育基上的培育物接種于各發(fā)酵管，

3、將各發(fā)酵管于37培育1824小時。取出并觀察記錄現(xiàn)象。（注意每次使用接種針前都應(yīng)用酒精燈火焰進(jìn)行滅菌） 動力檢查：用已滅菌的接種針取KIA培育基上的培育物分別接種于蛋白胨水、尿素培育基、半固體培育基中，將各個培育基于37培育1824小時。取出后將靛基質(zhì)（吲哚）加入到蛋白胨水培育基中，并觀察記錄現(xiàn)象。（注意每次使用接種針前都應(yīng)用酒精燈火焰進(jìn)行滅菌） 血清學(xué)鑒定：取潔凈玻片一張，將其用蠟筆分為兩格，兩邊各取生理鹽水一滴，再用已滅菌的接種環(huán)分別取KIA培育基上的培育物加入兩格中，與生理鹽水混勻不攤開。（注意每次使用接種環(huán)前都應(yīng)用酒精燈火焰進(jìn)行滅菌）然后在其次格中滴入一滴傷寒診斷血清，混勻不攤開，輕輕

4、搖動玻片，經(jīng)12min觀察兩格中有無凝集現(xiàn)象。注：本實驗涉及細(xì)菌接種都應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，由于條件有限，因而可在燃燒的酒精燈四周進(jìn)行實驗操作。4、 實驗結(jié)果與分析（1） EMB培育基現(xiàn)象與分析： 培育基下部呈現(xiàn)黑色現(xiàn)象，上部培育基仍為紅色，培育基斜面有細(xì)菌明顯集中生長。 分析：培育基下部消失黑色現(xiàn)象，說明該細(xì)菌能夠分解培育基中的物質(zhì)并產(chǎn)出硫化氫氣體，由于培育基中含鐵，因而硫化氫能夠與其結(jié)合成硫化鐵，消失黑色現(xiàn)象；而上部因重力含鐵量較少，產(chǎn)生的硫化氫氣體又部分揮發(fā)，只有少部分能夠與少量鐵結(jié)合，故產(chǎn)生的現(xiàn)象不明顯，上部仍呈現(xiàn)紅色。（2）生化鑒定現(xiàn)象與分析： 葡萄糖發(fā)酵管：管內(nèi)培育基指示劑由紫色變成

5、黃色，其內(nèi)可見細(xì)菌有明顯生長現(xiàn)象，無氣泡產(chǎn)生。分析：培育基指示劑由紫色變成黃色，說明該細(xì)菌能夠分解葡萄糖并產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，使得指示劑內(nèi)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變。 乳糖發(fā)酵管：管內(nèi)培育基指示劑顏色不發(fā)生轉(zhuǎn)變，仍為紫色，有明顯細(xì)菌生長現(xiàn)象，無氣泡產(chǎn)生。分析：培育基指示劑不發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變，說明該細(xì)菌能分解乳糖但不能產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，使得管內(nèi)指示劑無明顯現(xiàn)象。 甘露醇發(fā)酵管：管內(nèi)培育基指示劑由紫色變成黃色，其內(nèi)可見細(xì)菌有明顯生長現(xiàn)象，無氣泡產(chǎn)生。分析：培育基指示劑由紫色變成黃色，說明該細(xì)菌能夠分解甘露醇并產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，使得指示劑內(nèi)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生顏色轉(zhuǎn)變。（3）動力檢查現(xiàn)象與分析： 尿素培育基：管內(nèi)培育基指示劑顏色無

6、明顯變化，但有明顯氣泡產(chǎn)生，有明顯細(xì)菌生長現(xiàn)象。分析：管內(nèi)培育基指示劑無明顯顏色轉(zhuǎn)變，說明該細(xì)菌不能分解尿素，但培育基中其他物質(zhì)成分可以使細(xì)菌分解產(chǎn)氣，因而產(chǎn)生氣泡。 蛋白胨水：管內(nèi)指示劑顏色無明顯變化，有明顯細(xì)菌生長現(xiàn)象，無氣泡產(chǎn)生。加入靛基質(zhì)（吲哚）試劑后不消失玫瑰紅色。分析：加入靛基質(zhì)指示劑后不呈現(xiàn)玫瑰紅色，說明該細(xì)菌不能分解培育基中的色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)，因而靛基質(zhì)指示劑不能與之發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，消失顏色變化。 半固體培育基：管內(nèi)指示劑顏色無明顯變化，有明顯細(xì)菌沿穿刺線集中生長現(xiàn)象，無氣泡產(chǎn)生。分析：細(xì)菌能夠沿穿刺線生長，說明該細(xì)菌有鞭毛，能運動，有助于鑒別細(xì)菌種類。（4）血清學(xué)鑒定現(xiàn)象與分析

7、： 現(xiàn)象：通過玻片兩邊對比，在加有傷寒桿菌診斷血清的其次個格子中周圍液體清亮，有明顯凝集現(xiàn)象；另一格液體表面渾濁，無凝集現(xiàn)象。 分析：其次格中加入傷寒桿菌診斷血清消失凝集現(xiàn)象，說明接種細(xì)菌應(yīng)為傷寒桿菌，二者特異性結(jié)合產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，因而呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象；而第一格中未加入傷寒桿菌診斷血清，接種細(xì)菌無相應(yīng)抗體，不能產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，所以不呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象。綜上：葡萄糖甘露醇乳糖靛基質(zhì)硫化氫尿素分解動力現(xiàn)象由此推斷：該細(xì)菌應(yīng)為乙型副傷寒桿菌。5、 實驗總結(jié)本次實驗所需材料較多，實驗流程較簡單，需要動手操作的步驟較頻繁，因而在實驗過程中需要多加注意操作方法。 在實驗進(jìn)行前應(yīng)生疏掌握實驗的操作步驟及流程，了解實驗操作的方法，以便實驗的順利進(jìn)行。 實驗應(yīng)在無菌操作下進(jìn)行，如可在燃燒的酒精燈四周進(jìn)行細(xì)菌接種（注意酒精燈平安，切勿灼燒自己或是實驗儀器，防止事故的發(fā)生）。 細(xì)菌的培育應(yīng)在適宜的環(huán)境下進(jìn)行，避開外界環(huán)境影響細(xì)菌的生長繁殖（由于實驗室已配備培育箱，故消失問題不大，由于實驗室操作者較多，須做好相應(yīng)的標(biāo)記）。 從EMB中