抗糖尿病并發(fā)癥醛糖還原酶抑制劑的虛擬篩選（基于SPECS分子庫）

1、抗糖尿病并發(fā)癥醛糖復原酶抑制劑的虛擬篩選基于 SPECS 分子庫#張建羽，李哲，羅海彬*51015中山大學藥學院，廣州 510006摘要：醛糖復原酶抑制劑ARI通過抑制醛糖復原酶的活性，使得葡萄糖代謝途徑恢復良性進而控制或治療并發(fā)癥，而成為當今治療糖尿病并發(fā)癥的新藥研發(fā)熱點，并相繼有多種藥物進入臨床試驗以及上市。醛糖復原酶ALR2屬于醛-酮復原酶超家族中的一員，由于與體內(nèi)的醛復原酶ALR1有著高度的同源性，活性口袋相似，因而目前的 ARI，一方面普遍療效較低，缺乏良好的動力學參數(shù)，另一方面也會抑制體內(nèi) ALR1 的正?；钚远a(chǎn)生毒副作用。因而尋找高效、對 ALR2 有高選擇性的抑制劑成為 AR

2、I 研發(fā)的關鍵。相對于傳統(tǒng)篩選模型，利用計算機藥物輔助設計技術虛擬篩選尋找活性化合物，再進一步進行生物學實驗，可大大縮短藥物發(fā)現(xiàn)的時程。本文采用 Accelrys Discovery Studio 中的 LigandFit 和CODCKER 對接方法對小分子 SPECS 數(shù)據(jù)庫中的 400,000 多個分子，基于 ALR2 的 3 個靶標分子1US0、2FZD 和 2PDK的活性結合口袋進行虛擬篩選，并采用 3H4G 代表 ALR1作為活性篩選的對照蛋白，得到了 13 個具備較好預測活性與選擇性的目標小分子。本研究為基于靶標結構的藥物分子設計提供了指導思想。關鍵詞：計算機藥物輔助設計；糖尿病及

3、其并發(fā)癥；醛糖復原酶；虛擬篩選中圖分類號：R914.220Virtual Screening of Aldose Reductase Inhibitors forDiabetic Complications on SPECSZHANG Jianyu, LI Zhe, LUO Haibin(School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510006)25303540Abstract: Aldose reductase inhibitors (ARI) can decrease the activity o

4、f aldose reductase (ALR2)and thus can be used for the treatment of diabetic complications. A variety of ARIs have beenapproved in clinical trials or in the market. ALR2 belongs to the aldo-keto reductase (AKR)superfamily of enzymes, while aldehyde reductase (ALR1), the homologous enzyme, shares ahig

5、h degree of sequence identity and similar binding-site pocket as ALR2. As a result, the existingARIs generally have side effects due to their low selectivity towards ALR1. Therefore, thescreening of new leads for ALR2 with high selectivity is the key for the development of ARI. Inthe present work, w

6、e describe a virtual screening experiment on SPECS (a database of 400, 000molecules) by using the molecular docking methods, LigandFit and CDOCKER in AccelrysDiscovery Studio 2.5.5 based on three crystal structures (1US0, 2FZD, and 2PDK), and finallyachieve a result of 13 hit molecules which exhibit

7、 strong binding affinities with ALR2theoretically and high selectivity towards ALR1.Keywords: Aldose reductase; virtual screening; CADD; Complications of diabetes0 引言近年來糖尿病的患病率呈逐漸上升的趨勢。據(jù) 2021 年的一份統(tǒng)計報告指出，我國糖尿病患者已突破了 9 000 萬，同時其治療費用每年達 1 734 億元人民幣約 250 億美元，糖尿病所致的直接醫(yī)療開支已經(jīng)占到中國醫(yī)療總開支的 13%1。糖尿病本身可以通過胰島素和降血

8、糖藥得以治療，但由于高血糖能夠引發(fā)諸如心腦血管并發(fā)癥、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，腎病，基金工程：高等學校博士學科點專項科研基金20210171120057、廣東省自然科學基金S2021030003190作者簡介：張建羽，1991-，男，學生，主要研究方向：計算機輔助藥物設計。通信聯(lián)系人：羅海彬，1977-，男，教授，主要研究方向：藥物分子設計。E-mail: -1-眼病等，大大增加了因糖尿病并發(fā)癥而導致死亡的概率。有研究說明，醛糖復原酶ALR24550在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制中起到一個關鍵的作用，其受高血糖刺激而異?；顫姴е露喾N并發(fā)癥。因此，醛糖復原酶抑制劑A

9、RI成為當前治療糖尿病并發(fā)癥的一個重要方向；但目前市場上該類藥物較少，選擇性低，且都存在較大副作用，不具備良好的藥動學參數(shù)，因此需要研發(fā)新的 ARI。因此，本研究旨在通過計算機輔助藥物分子設計技術2，針對 SEPCS小分子數(shù)據(jù)庫，篩選出對 ALR2 具有較高選擇性的和較高活性的 ARI，用于治療、控制或減緩糖尿病并發(fā)癥，進而降低由糖尿病及其并發(fā)癥引起的死亡率。1 相關概念1.1藥物的虛擬篩選藥物的虛擬篩選 (Virtual screening for drug discovery)，是指基于藥物設計理論，借助計算機技術和應用軟件，采用分子對接或藥效基團模型方法，從大量化合物中篩選出具有較高55

10、理論結合能力的化合物，從而快速進入藥理藥效實驗，這樣可以明顯地縮短苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)時間，提高藥物研發(fā)的效率；其陽性率一般在 5%20%，遠遠高于傳統(tǒng)的高通量篩選2。1.2糖尿病并發(fā)癥及醛糖復原酶ALR2葡萄糖代謝機制在目前的研究中，被認為是誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥的主要途徑3-4。在人體中葡萄糖存在一個多元醇代謝途徑如圖 1 所示：606570圖 1. 葡萄糖多元醇代謝途徑Figure 1. The polyol pathway of glucose metabolism在圖 1 所展示的多元醇代謝途徑中, 可以看到, ALR2 是一個非常關鍵的催化酶-限速酶3原酶超家族，由 316 個氨基酸殘基構成

11、，是一個分子質(zhì)量為 35858 D 的多肽，其中含有 38%的螺旋結構和 14%的桶狀結構。通過蛋白晶體研究及與配體相互作用研究，發(fā)現(xiàn)其活性口袋位于鏈的 C-末端，是一個由芳香族氨基酸、非極性氨基酸和極性氨基酸組成的疏水口袋。其中的 48 位酪氨酸 Tyr 和 110 位組氨酸 His 參與酸堿催化作用5，并且在與底物的結合過程中起到非常重要的作用，也是競爭性抑制劑重要的作用位點。其蛋白晶體如下列圖 2所示。圖 2. 醛糖復原酶 ALR2 的晶體結構1US0: 0.66Figure 2. The crystal structure of ALR21US0: 0.66 -2-。研究說明：醛糖復原

12、酶 ALR2 是一種復原型輔酶NADPH-依賴型復原酶，屬于醛-酮還752 研究對象及方法2.1實驗對象有研究說明，配體對 ALR2 的活性口袋具有較強的誘導效應，存在著較多的活性口袋構象。其中的三種蛋白晶體1US0：0.66 ；2FZD：1.08 ；2PDK：1.55 在諸多實驗中，被證實可以用來代表 ALR2 因誘導效應而產(chǎn)生變化的活性口袋構象6，因而在實驗中也采用80了這三種蛋白晶體作為靶標分子的結構。另一方面，實驗中采用了醛復原酶ALR1蛋白晶體 3H4G1.85 作為對照蛋白。用以篩選出對醛糖復原酶ALR2具備較高選擇性的化合物7。2.2實驗方法本實驗中采用對照蛋白陽性篩選法，通過設

13、立相關閾值，逐步縮小篩選范圍，最終確定85對 ALR2 具備較高理論結合能力，對 ALR1 有較低理論結合能力的小分子。2.2.1虛擬篩選方法確實定目前我們已有的對接篩選程序有 Accelrys Discover Studio 2.5.5 的 LigandFit 和CDOCKER, Tripos Sybyl 7.3 的 Surflex-dock, 和 MOE2021.10 的 Dock。不同的篩選方法對不同的靶蛋白有不同的系統(tǒng)適應性，需采用 RMSDroot-mean-square deviation值來選擇合90適的篩選程序。篩選程序結果如表 1 所示。表 1 所列的數(shù)據(jù)，紅色標記的數(shù)據(jù)多為

14、 1.0 附近，說明此種篩選方法對相應的蛋白晶體具備較好的篩選系統(tǒng)適應性，可以較為準確地預測晶體結構中的原有小分子配體。分析表 1 的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) Accelrys Discover Studio 中的兩種對接方法對于本實驗的蛋白晶體具備較好的系統(tǒng)適應性。因而，本實驗采用 LigandFit 和CDOCKER 進行虛擬篩選。95表 1. 四種對接方法 surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKER 的 RMSD 值Table 1. RMSDs of the four docking methods (surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKERMet

15、hodologysurflex-dock MOE LigandFit CDOCKERAverage RSD Average RSD Average RSD Average RSD1US0 1.34 0.55 5.10 2.45 3.65 1.36 1.10 0.212FZD 2.99 1.84 3.01 1.77 1.04 0.38 0.454 0.102PDK 4.94 2.16 4.87 1.68 1.34 1.50 3.90 1.263H4G 4.84 0.3 5.26 2.00 4.64 0.05 3.80 1.612.2.2篩選閾值確實立100本實驗采用來自 DUD 數(shù)據(jù)庫中 26

16、個 ALR2 配體小分子、BindingDB 中 165 個 ALR2配體小分子，7 個 ALR1 晶體蛋白原配體小分子進行相關閾值確實立。結果如表 2 所示。105110115-3-表 2. LigandFit 和 CDOCKER 的篩選閾值Table 2. The selected scores for LigandFit and CDOCKER in our virtual screening篩選閾值1US0數(shù)值2FZD 2PDK3H4G所采用的數(shù)據(jù)庫應用的對象LigandFit結果篩選閾值Ligscore-PLP1-PLP2Dockscore2.45106.69105.22101.09

17、1.7790.5388.4186.582.6095.0093.3890.82DUD用于 ALR1&ALR2LifgandFit 對接結果的篩選CDOCKER 結果篩選閾值37.05 32.61 34.79 BindingDB用于 ALR1&ALR2CDOCKER 對接結果的篩選LigandFitLigscore2.19DUD用于判斷分子是否對陽性篩選閾值-PLP1 86.45-PLP2 82.82Dock 82.60scoreALR1 顯示陽性；CDOCKER 陽性篩選閾值 35.60PDB 上的 ALR1 所包含的配體小分子用于判斷分子是否對ALR1 顯示陽性2.2.3對照蛋白的陽性篩選及抑

18、制劑的選擇性120人體內(nèi) ALR1 與 ALR2 同屬醛-酮復原酶超家族AKR, 兩者具有約 65%的氨基酸序列同源性7了 ALR2 的同時，也抑制了 ALR1 的正?；钚?，由于選擇性低而產(chǎn)生毒副作用。為了使得篩選出來的活性化合物對 ALR2 具備較高選擇性，本次實驗采用 ALR1 的蛋白晶體 3H4G 作為對照，利用小分子對 3H4G 產(chǎn)生具有預測活性的打分結果作為陽性值，在命125中小分子中去除顯陽性的結果，從而保證實驗所得的小分子對 ALR2 具有較高的預測選擇性。2.2.4熱點殘基分析根據(jù)文獻報道8，ALR2 活性口袋的重要殘基主要為 Trp20、Tyr48、His110、Trp111

19、、Phe122、CYS298 和 Leu300 等。為了進一步確定本次實驗中需要重點研究及分析的結合位130135點，本文從 PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫中下載 116 個 ALR2 晶體蛋白進行熱點殘基分析。在 MOE 的 PILF 中導入 116 個晶體蛋白，以 1US0 氨基酸序列為基準，去除序列與 1US0不同的蛋白晶體，進一步去除無內(nèi)源性小分子的蛋白晶體；每個蛋白晶體保存 1 個內(nèi)源性小分子配體，經(jīng)此篩選共有 59 個蛋白晶體結構進行熱點殘基分析。經(jīng)分析得知，ALR2 的主要結合位點在于 Tyr48、His110 和 Trp111，同時 Leu300 及 B 鏈 C 端的氨基酸殘基如 CYS2

20、98也具有重要的奉獻；經(jīng)文獻7得知，Leu300 及鏈 C 端的氨基酸殘基對 ARI 的選擇性有重要奉獻，可以認為是 ARI 作用于 ALR2 的特異性位點。3 研究過程3.1蛋白晶體預處理對從 PDB 數(shù)據(jù)庫中下載得到的蛋白晶體進行水分子去除、多像異構體去除和酸分子去140除8子進行質(zhì)子化處理，使得在 -N 形成 1 氫鍵供體；除此之外，對輔酶 NADP 中所存在的煙酰胺的芳香環(huán)添加+1 電荷，以保證對接軟件最大限度模擬真實環(huán)境。-4-，且兩者的活性口袋具有非常高的相似度。對于一般的 ARI 而言，往往在抑制等三項預處理；進一步對蛋白晶體活性口袋重要氨基酸殘基 His110 咪唑環(huán)上的 -氮

21、原LigandFit 及 CDOKCER 的篩選LigandFit 的虛擬對接篩選145將經(jīng)過預處理的晶體蛋白導入 LigandFit 程序，設置打分函數(shù)為 LigScore1、PLP1、PLP2，設定每個小分子保存對接結果打分最高的構象。運行結果如表 3 所示。表 3. LigandFit 篩選結果Table 3. Result from the LigandFit method分子庫名字SPECS 數(shù)據(jù)庫經(jīng)閾值篩選的結果經(jīng)陽性對照蛋白篩選的結果所含小分子數(shù)400 0004 0683 1201503.2.2經(jīng) ADMET 類藥性分析的結果CDOCKER 的虛擬對接篩選1 95

22、5將 以 上LigandFit的 對 接 結 果 導 入 到CDOCKER程 序 ， 采 用-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY 進行對接打分，每個小分子保存對接結果打分最高的構象9，運行 CDOCKER。運行結果如表 4 所示。155表 4. CDOCKER 篩選對接結果Table 4. Result from the CDOCKER methods篩選項 經(jīng)閾值篩選的結果 經(jīng)陽性對照蛋白閾值篩選結果 篩選結果 427 67 4 討論分析本文經(jīng)過以上虛擬篩選，得到了 67 個小分子化合物，而后進行結合模式分析、與已上市藥物或臨床研究中藥物比照分析。1604.1結合模式分析根

23、據(jù)已有文獻的報道以及本文的熱點殘基分析，具備較好預測活性的命中小分子與ALR2 蛋白晶體需滿足一下條件：與 Tyr48、His110、Trp111 三個氨基酸殘基至少形成一個氫鍵作用力；與 Trp111 存在-共軛作用?；谝陨蠗l件，對 67 個 CDOCKER 篩選結果進行結合模式的分析，得到 13 個符合此條件的命中小分子，其與 3 種 ALR2 蛋白晶體的結合165情況如表 5 所示。表 5. 13 個命中小分子與 3 種 ALR2 蛋白晶體的結合模式Table 5. Binding modes between thirteen hits and three A LR2 structur

24、es分子 ID 號相互作用情況1US02FZD2PDKH-Bonds-H-Bonds-H-Bonds-InteractionInteractionInteractionTyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20AG-690/12373383AG-690/12373386AG-690/12472597AG-690/40752021AH-487/42197325AK-918/12272134AK-968/15360839AK-968/41845152AK-968/41925

25、125AM-807/14147550AN-329/13481005AG-690/15431187AG-690/15436375-5-13 個小分子的 CDOCKER 打分結果如表 6 所示。170SPECS ID表 6. 13 個命中小分子的 CDOCKER 打分結果Table 6. The CDOCKER scores (kcal/mol) from of 13 compoundsCDOCKER_INTERACTION_ENETGY Molecular WeightAG-690/12373383 41.27 353.36AG-690/12373386 39.67 373.78AG-690/1

26、2472597 39.43 303.24AG-690/40752021 41.59 333.41AH-487/42197325 39.58 365.33AK-918/12272134 45.17 335.35AK-968/15360839 43.31 301.77AK-968/41845152 39.00 346.16AK-968/41925125 41.38 320.73AM-807/14147550 38.91 364.29AN-329/13481005 39.47 258.27AG-690/15431187 43.87 369.78AG-690/15436375 38.25 265.26

27、4.2與已上市藥物或臨床研究藥物的比照分析目前已上市的藥物包括 sorbini、minalrestat、ranirestat(AS-3201)和 fidarestat。將這些上175市的藥物的分子結構包含在一個新建的分子庫中，使用 CDOCKER 對三種靶標蛋白進行對接打分，并將結果與 13 個命中化合物作比照，評價這四化合物的預測活性表 7。表 7. Sorbini, Minalrestat, Ranirestat (AS-3201) 和 Fidarestat 的 CDOCKER 打分Table 7. The CDOCKER scores of Sorbini, Minalrestat, R

28、anirestat (AS-3201) and Fidarestat-CDOCKER_INTERATION_ENERGY (kcal/mol)上市藥物1US0 2FZD 2PDK平均打分sorbini 30.75 26.18 31.36minalrestat 46.50 38.37 42.31ranirestat 44.91 40.01 39.69fidarestat 42.90 29.84 37.5529.4342.3941.5436.76打分均值37.53180本文中，所命中的 13 小分子的對接打分均值為 37.88，大于以上四種藥物的 CDOCKER打分均值，因而所命中的局部小分子的預

29、測活性高于或偏高于已有上市藥物。5 結論從 SPECS 數(shù)據(jù)庫篩選得到 13 個小分子表 6，它們對 ALR2 具有較好的預測活性，185190195且與 ALR2 的結合模式符合現(xiàn)有研究的預測模型和 ALR2 晶體結構中的 Tyr48，His110 和Trp111 均顯示出相互作用，其-CDOCKER INTERACTION ENERGY 均處于較為理想的打分區(qū)間 34.49 42.93 kcal/mol。本實驗采用了對照蛋白陽性篩選的實驗方法，利用 ALR1 的3H4G 晶體蛋白作為對照，從對 ALR2 的篩選結果中剔除對 3H4G 顯示陽性的小分子，以確保所命中的小分子對 ALR2 具備

30、較高的選擇性。所命中的小分子對 3H4G 的對接打分已低于所設閾值，僅有局部小分子與 3H4G 的 His113 存在氫鍵作用，因而所命中的小分子理論上對 ALR2 有較高的選擇性。參考文獻 (References)1 中 華 醫(yī) 學 會 糖 尿 病 學 分 會 CDS 和 IDF. 糖 尿 病 知 識 - 中 國 糖 尿 病 患 者 數(shù) 居 全 球 之 首OL.2021-07-18. :/ tnbzy /html/540-56/56626.html2 李貞雙,李超林.計算機輔助藥物設計在新藥研究中的應用J. Computer Knowledge and Technology 電腦-6-知識與

31、技術，2021， 531：8812-8813.3 黃偉, 唐燦.黃酮類醛糖復原酶抑制劑的研究進展J. 時珍國醫(yī)國藥,2021， 206：1470-1471.4 朱長進.抗糖尿病并發(fā)癥藥物-醛糖復原酶抑制劑J. Chin. J. New Drugs,2021,18,(4),303-306.2002052102155 谷娟 ,嚴謹 ,吳衛(wèi)華 , 黃琪 , 歐陽冬生 . 醛糖復原酶的研究進展 J. 中南大學學報 (醫(yī)學版 ) 2021,35( 4 ),395-400.6 Sandro Cosconati, Luciana Marinelli, Concettina LaMotta, Stefania Sartini, Federico Da Settimo, Arthur J.Olson, and Ettore Novellino. Pursuing