動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室疾病診斷工作流程

1、生物實(shí)驗(yàn)室疾病診斷工作流程流程：業(yè)務(wù)接收流程：客戶內(nèi)勤研發(fā)部生物實(shí)驗(yàn)室業(yè)務(wù)反饋流程：生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)勤客戶實(shí)施細(xì)則:一、樣品采集與運(yùn)輸1.病料的采集要求：（1）新鮮，代表性。病料存放時(shí)間夏天少于6h，冬天12-24h.（2）減少污染。第一時(shí)間采取病料，減少病料因暴露于空氣中而造成的污染。（3）病料采集后，應(yīng)先存放于冰箱中1-2小時(shí)后，再做微生物檢驗(yàn) 2.病料的采集方法（1）組織和實(shí)質(zhì)器官的采集 采集病料心、肝、脾臟、胰腺、肺等，剪切小塊組織，放入滅菌試管（青霉素瓶），密封。（2）液體病料的采集 血液、膽汁、膿腫液、滲出物等液體病料，使用注射器（或滅菌吸管）吸取病變組織的液體，將病料注入滅菌試管（青

2、霉素瓶），塞好棉塞送檢。（3）全血的采集方法 用注射器自雞的心臟或翅靜脈采血2-5毫升，注入滅菌試管（青霉素瓶）中。（4）血清的采集方法 用滅菌注射器自雞的心臟或翅靜脈采血2毫升，注入滅菌試管中（青霉素瓶）擺成斜面，待血液凝固血清析出后，將血清吸出注入另一個(gè)滅菌試管中，備用。采樣的比例：按每個(gè)舍0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常規(guī)采樣15-30份即可。二、檢測項(xiàng)目項(xiàng)目一、藥敏試驗(yàn)一、 試驗(yàn)步驟 1.試驗(yàn)材料：培養(yǎng)基、藥敏試紙、細(xì)菌、接種環(huán)、酒精燈、打孔器、移液器、滴頭。2.試驗(yàn)準(zhǔn)備：藥液的制備(用于商品藥的試驗(yàn))：按商品藥使用治療量的比例配制藥液；如商品藥“百病消”按其說明量治療

3、量0.01%飲水，可按這個(gè)比例配制藥液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。 3.試驗(yàn)操作方法：3.1藥敏片法 在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)(酒精燈)火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。(另可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面，涂布均勻致密)。 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)

4、基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片(外周一般可貼七片)，每種藥敏片的名稱要記住。 將平皿培養(yǎng)基置于37溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。 二、結(jié)果觀察： 過夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。 三、結(jié)果判定 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)條件不同，判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同。對于一般抑菌環(huán)的直徑，20 mm以上極敏;15 mm以上者為高度敏感；

5、10-15 mm為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán)者為耐藥。抗菌藥物紙片含藥量(g /mL) 抑菌圈直徑(mm) 不敏感低度敏感中度敏感敏感青霉素5001010 26 26鏈霉素5000101015 15氯霉素7000101020 20新霉素3000101025 25多黏菌素抑菌圈在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。 四、應(yīng)用 藥物敏感試驗(yàn)后，應(yīng)選擇高敏藥物進(jìn)行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用。在選擇高敏藥物時(shí)應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，這樣才會(huì)達(dá)到好的治療效果。項(xiàng)目二、抗體試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)用設(shè)備： 離心機(jī) 1臺(tái) 、冰箱 1臺(tái)、振蕩器 1臺(tái)、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸頭

6、、積液槽、一次性采血管、2毫升注射器、紅細(xì)胞、檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀、硫酸、吸管、吸耳球、針頭、蒸餾水、10毫升離心管 、生理鹽水。二、實(shí)驗(yàn)過程：（一）血凝（HA）試驗(yàn)：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價(jià) （二）4單位抗原校正： （三）血凝抑制（HI）試驗(yàn)：每排孔檢查1份血清。（四）結(jié)果判定：1）判定結(jié)果：以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的HI滴度，以2的指數(shù)表示。2）判定標(biāo)準(zhǔn)： 1.新城疫抗體：育雛育成雞在7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。 2.H5抗體：抗體值在6以上。 3.H9抗體：抗體值在7以上。 注：低于以上標(biāo)準(zhǔn)，則需要進(jìn)行免疫。 3)免疫后抗體規(guī)律 一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體

7、，2-3周抗體到達(dá)峰值，可以維持2個(gè)月。滅活疫苗免后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達(dá)峰值，可以維持3-4個(gè)月。項(xiàng)目三、PCR檢測一、PCR反應(yīng)的條件設(shè)置PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。1溫度與時(shí)間的設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。2循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度，一般的循環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。三、PCR結(jié)果異常分析PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，