柱層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告(2023215021)

1、柱層析別離色素一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康?】1 了解柱層析的分類 ，掌握各種柱層析的原理 。2 熟練掌握吸附層析的原理和操作技術(shù) 。二、【實(shí)驗(yàn)原理 】葉綠體色素是植物吸收太陽(yáng)光能進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì) ， 主要有葉綠素 a、 葉綠素 b、 胡蘿卜素和葉黃素組成 。 從植物葉片中提取和別離葉綠體色素是對(duì)其認(rèn)識(shí)和了解的前提。利用葉綠體色素能溶于有機(jī)溶劑的特性 ， 可用 95%乙醇或無(wú)水乙醇提取 。別離色素的方法有多種 ，如紙層析 、柱層析等 。柱層析法是色譜法中的一種 ， 它是根據(jù) 混合物中各組分對(duì)固定相的吸附能力 ，以及對(duì)洗脫劑 即移動(dòng)相 的溶解度不同將各組分別 離。 常用的柱色譜有吸附色柱譜和分配柱色譜兩

2、類 。 吸附柱色譜通常是在玻璃管中填入外表 積很大 ，經(jīng)過(guò)活化的多孔性物質(zhì)或粉狀固體作為吸附劑 如氧化鋁或硅膠 ， 當(dāng)混合物的溶液 流經(jīng)吸附柱時(shí) ，就被吸附在柱的上端 ，然后從柱頂參加溶劑 洗脫劑 洗脫 。由于不同化合物 在吸附柱上的吸附能力不同 ， 在同一溶劑中的溶解度也不同 ，因此各組分隨溶劑以不同速度下 移， 形成色帶 。繼續(xù)用溶劑洗脫 ，吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先流出 ，整個(gè)層析過(guò)程進(jìn)行 反復(fù)的吸附 - 解析- 再吸附- 再解吸。用柱層析法可以分別收集各組分 ，并逐個(gè)鑒定 。本實(shí)驗(yàn)是把三氧化二鋁填入玻璃管中 壓成柱狀 作為吸附劑 ， 將葉綠體色素的石油醚 提取液傾于吸附柱上 ，色素

3、即被吸附 。由于色素的種類不同 ，被吸附的強(qiáng)弱不同 ， 就在吸附柱 上排列成為不同的色層 ， 再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力， 用不同的溶劑進(jìn)行洗脫，從而到達(dá)葉綠體主要的 4種色素葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡蘿卜素的別離。三、 【實(shí)驗(yàn)材料 】原料：新鮮的菠菜葉試劑 ：1 無(wú)水乙醇或 95% 乙醇5.三氧化二鋁2石英砂 6飽和氯化鈉溶液3丙酮 7.水硫酸鈉4石油醚60-90 C8洗脫液：丙酮：石油醚=1 : 9器材：層析柱1 x 30cm, 研缽，蒸餾裝置，脫脂棉 ， 天平 ， 燒杯， 過(guò)濾漏斗 ， 玻璃棒 ， 錐形瓶 ， 分液漏斗 ， 試管 ， 鐵架臺(tái)四、 【實(shí)驗(yàn)操作 】1 色素的提

4、取 ：20 克菠菜 ，加少許石英砂 ，再加 20 毫升無(wú)水乙醇研磨成漿 ， 脫脂棉過(guò)濾 ，保存濾液 ， 濾渣再用無(wú)水乙醇提取一次 ，合并濾液 ，濾渣再參加 30 毫升石油醚提取一次 ，過(guò)濾 ，合并濾 液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中 ,再參加 40 毫升飽和氯化鈉溶液震蕩 ，棄去下層溶液 ，再分別參加 20 毫升水震蕩洗滌幾次 ，直至下層無(wú)色 ，保存上層溶液 ， 轉(zhuǎn)移至三角瓶中 ，參加無(wú)水硫酸鈉枯燥5 分鐘，備用 .， 蒸除多余的石油醚 ，至剩余液體 5-8 毫3 層析拄的制備 ：15 克堿性三氧化二鋁參加 析拄內(nèi)參加一團(tuán)棉花在底部 將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi) 醚洗柱內(nèi)壁 ， 頂部加一小團(tuán)棉花2 樣品的

5、濃縮 ： 將提取液放入蒸餾燒瓶中 升左右 ， 以備加樣使用 。30 毫升石油醚攪拌 ，浸泡 10min. 。 在層，再參加石英砂 0.5cm 以上 ，然后用石油醚半充滿柱子 ，再 ， 倒時(shí)應(yīng)該緩慢 ，重復(fù)使用下面的石油醚 ，直到裝完 。用石油 ， 然后再填入石英砂 0.5 厘米高 。3 樣品的別離層析 ：吸附層析別離色素翻開(kāi)層析拄下部開(kāi)關(guān) ， 向拄內(nèi)參加 2 毫升濃縮液 ，至液體沒(méi)入砂內(nèi) ， 再參加石油醚沖洗拄壁 ，液體浸入砂內(nèi) ， 加洗脫液開(kāi)始層析 ，可以看到不同色帶如圖片 1，直至第一條色帶洗脫完畢 ，在拄下面用試管接收第一條色帶的洗脫液 ，如圖片 2 。五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果 】 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如以下

6、圖 ： 圖一 ：層析柱中出現(xiàn)黃色帶 圖二 ：提取出的黃色胡蘿卜素 結(jié)果分析 ： 洗脫過(guò)程中 ， 首先有一條黃色的色帶圈沿著層析柱下移，色帶圈的各個(gè)方向的移動(dòng)速度并不是完全相同 ， 原因在于層析柱的制作過(guò)程并不完全均一 ，使層析柱內(nèi)部不均勻 ，以至于色 帶各方向的移動(dòng)速度不同 。 最后收集得到亮黃色的胡蘿卜素 。七、【考前須知 】1 、萃取時(shí)不要?jiǎng)×艺袷?，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象 。2 、為了保持柱子的均一性 ， 使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否那么當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí) ， 就會(huì)使柱身干裂 ，影響滲透和顯色的均一性 。因此要保證整個(gè)裝樣過(guò)程中溶 劑要高于三氧化二鋁的外表 。3 、在吸附劑

7、上端參加脫脂棉 或?yàn)V紙 是使加樣品時(shí)不致把吸附劑沖起 ；在吸附柱下端 加脫脂棉 或沙子 可以防止吸附劑細(xì)粒流出 。4 、層析柱填裝緊密與否 ，對(duì)別離效果很有影響 ，假設(shè)各局部松緊不勻 ，會(huì)影響滲透速度 和顯色的均勻 。6 、洗脫流速不宜過(guò)快 ，防止因此壓緊凝膠 ，色素別離不開(kāi) ； 也不要過(guò)慢 ，使柱裝得太 松， 導(dǎo)致層析過(guò)程中 ，凝膠床高度下降 ，色素洗脫很慢 。因此應(yīng)控制洗脫流速 ，以每分鐘 6080 滴為宜 。7 、樣品一定要足夠濃縮 ，加樣量不要過(guò)大 ，過(guò)大 ，別離條帶過(guò)寬 ，如果層析拄不夠長(zhǎng) ， 各組分不易分開(kāi) ， 易同時(shí)洗脫下來(lái) ；加樣量過(guò)少 ，色帶不是很清楚 ，不易觀察 ，效果不好

8、 。8 、層析柱粗細(xì)必須均勻 ，柱管大小可根據(jù)試劑需要選擇 。一般來(lái)說(shuō) ，細(xì)長(zhǎng)的柱別離效果 較好 。假設(shè)樣品量多 ，最好選用內(nèi)徑較粗的柱 ，但此時(shí)別離效果稍差 。柱管內(nèi)徑太小時(shí) ，會(huì)發(fā) 生“管壁效應(yīng) ，即柱管中心局部的組份移動(dòng)慢 ， 而管壁周圍的移動(dòng)快 。柱越長(zhǎng) ，別離效果越 好， 但柱過(guò)長(zhǎng) ，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng) ，樣品稀釋度大 ，別離效果反而不好 。八、【實(shí)驗(yàn)小結(jié) 】在該柱層析別離色素實(shí)驗(yàn)中 ，我了解了柱層析技術(shù)的相應(yīng)方法和原理 ， 學(xué)會(huì)了層析柱的 制作和準(zhǔn)備 ， 進(jìn)一步了解綠葉中色素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)、洗脫液的配比 、 層析柱的制作及洗脫液的流速是本實(shí)驗(yàn)成功與否的三大關(guān)鍵因素 。知識(shí)拓展

9、：1 、溶劑的選擇 ：1 吸附劑要求較純 ，否那么會(huì)影響樣品的吸附和洗脫 。2 溶劑和吸附劑不能起化學(xué)反響。3 溶劑的極性應(yīng)比樣品小，如果大了 ，樣品不宜被吸附劑吸附 。4 溶劑對(duì)樣品的溶解度不能太大，否那么影響吸附 ，但也不能太小 ，溶液的體積增加 ， 易使色譜分散 。5 可使用混合溶劑 ，如有的組分含有較多的極性基團(tuán) ，在極性小的溶劑中溶解度太小 。也可選用極性大的溶劑溶解 ， 然后參加一定量的非極性溶劑 。這樣既降低了 極性 ， 又減少了溶液的體積 。2 、洗脫劑的選擇 ：樣品吸附在氧化鋁柱上后， 用適宜的溶劑進(jìn)行洗脫， 這種溶劑稱為洗脫劑 。如果原來(lái)用于溶解樣品的溶劑沖洗柱不能到達(dá)別離

10、的目的 ， 可以改用其他溶劑 ，一般極性較強(qiáng)的溶劑影響 樣品和氧化鋁之間的吸附 ， 容易將樣品洗脫下來(lái)， 達(dá)不到別離的目的 。因此常用一系列極性漸次增強(qiáng)的溶劑 ， 既先使用極性最弱的溶劑 ，然后參加不同比例的極性溶劑配成洗脫溶劑。常用的洗脫溶劑的極性按如下次序遞增。己烷和石油醚V環(huán)己烷V四氯化碳V三氯乙烯V二硫化碳V甲苯V二氯甲烷V氯仿V乙醚V乙酸乙酯V丙酮V丙醇V乙 醇V甲醇V水V吡啶V乙酸。篇二：實(shí)驗(yàn)六：薄層層析與柱層析實(shí)驗(yàn)六 薄層層析與柱層析實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解偶氮苯的光學(xué)異構(gòu)反響 ，加深對(duì)光化學(xué)反響的理解 。2. 掌握薄層層析的根本操作, 薄層層析別離順 、反式偶氮苯 。3. 了解柱層析

11、別離有機(jī)化合物的原理 ，初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作方法4. 采用柱層析別離反式偶氮苯與靛紅的混合物實(shí)驗(yàn)原理偶氮苯是最簡(jiǎn)單的芳香偶氮化合物 ，眾多偶氮染料的母體結(jié)構(gòu)。 含有兩個(gè)苯基分別與偶氮基-n=n -兩端相連的結(jié)構(gòu)。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有順z-反e-異構(gòu)體。反式 為橙紅色棱形晶體 ，蒸氣為深紅色 ， 溶于乙醇 、乙醚、醋酸和水 。 反式的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定 。 當(dāng) 溶于乙醇的偶氮苯用一定強(qiáng)度的紫外光照射時(shí) ， 順式的比例逐漸增大 ， 直至到達(dá)平衡 ， 形成順 反異構(gòu)體的混合物 。偶氮苯的光致異構(gòu)是很多偶氮類功能材料光響應(yīng)的根底 。順式為橙紅色片 狀晶體 ， 不穩(wěn)定 ， 在加熱或可見(jiàn)光照射

12、下能夠變成反式 。色譜方法是通過(guò)在固定相和流動(dòng)相間分配的不同而將物質(zhì)別離開(kāi)。待別離混合物各組分在固定相上的吸附強(qiáng)度不同 ， 與流動(dòng)相一起移動(dòng)的速度也不同 ， 因此被別離開(kāi) 。薄層色譜屬于固 - 液吸附色譜 。 薄層色譜板中的固定相中的微孔結(jié)構(gòu)使得溶劑在毛細(xì)管作 用下能夠沿著色譜板向上移動(dòng) 。由于混合物中各組分對(duì)吸附劑 固定相 的吸附能力不同 ， 當(dāng) 展開(kāi)劑 流動(dòng)相 流經(jīng)吸附劑時(shí)發(fā)生無(wú)數(shù)次吸附解附過(guò)程 ，吸附力弱的組分隨流動(dòng)相迅速向前 移動(dòng) ， 吸附力強(qiáng)的組分滯留在后 ， 由于各組分具有不同的移動(dòng)速度 ，最終在固定相薄層析上別離 。 tlc 除了用于別離外 ，還可 以通過(guò)與結(jié)構(gòu)的的化合物比對(duì) ，

13、 鑒定少量有機(jī)混合物的組成 ， 它也是柱色譜尋求最正確展 開(kāi)劑的手段 。 上圖中紅色化合物的 rf 等于豎直紅線的長(zhǎng)度除以豎直藍(lán)線的長(zhǎng)度 。柱層析也屬于固 - 液吸附色譜 。 在一根玻璃 “別離柱 中進(jìn)行 。 管中裝上適當(dāng)?shù)姆勰┳鳛?國(guó)定相 。 待別離或純化物質(zhì)的溶液 流動(dòng)相 在重力作用下流經(jīng)吸附劑時(shí) ， 不同物質(zhì)對(duì)溶劑和 吸附劑的親和力不同 ， 因而被吸附的程度不同 ， 從而以不同速度流動(dòng) ， 使化合物得以別離 。 靛 紅與偶氮苯在極性上具有較大差異 ， 從而可以使用極性適中的展開(kāi)劑 ， 通過(guò)柱層析將二者別 離。儀器與試劑分析天平 ， tlc ，錐形瓶 ， 毛細(xì)管 ，層析柱 ， 棉花 ， 量

14、筒 ， 硅膠 ，蒸發(fā)皿 ，展缸 ； etoac, ch2cl2,石油醚 ， 靛紅 ； 請(qǐng)自帶尺子 用于計(jì)算 rf 值 顏老師在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前已經(jīng)準(zhǔn)備好的試劑：a. 偶氮苯的溶液 15 mg in 1mletoh ；b. 靛紅的溶液 15 mg in 1ml ch2cl2；c. 靛紅與偶氮苯的均勻混合物 靛紅 1.4 g + 偶氮苯 3.5 g 。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容a) 光照異構(gòu)化取 0.1 g 反式偶氮苯溶于 5 ml 無(wú)水乙醇中 ， 將此溶液放于試管中 ， 密封， 置于可見(jiàn)光 下二星期 ，以便與光照前的溶液進(jìn)行比照 。b) 薄層層析取管口平整的毛細(xì)管吸取光照后的偶氮苯溶液 ，在離薄層板邊沿約 0.5 c

15、m 的起點(diǎn)線上 點(diǎn)樣 。再用另一毛細(xì)管吸取未經(jīng)光照的反式偶氮苯溶液點(diǎn)樣 。待乙醇揮發(fā)后 ，將點(diǎn)好樣品的薄 層板放入內(nèi)襯濾紙的展缸中 。 展缸內(nèi)已放置展開(kāi)劑 乙酸乙酯 / 石油醚 =1/40 。薄層板的點(diǎn) 樣端在下方 ， 浸入展開(kāi)劑 ， 展開(kāi)劑不要沒(méi)過(guò)起點(diǎn)線 ， 也不要碰到樣品點(diǎn) 。 待展開(kāi)劑前沿上升到 離板的上端約 1 cm 處時(shí) ， 取出薄層板 ，立即用鉛筆在展開(kāi)劑上升的前沿處劃一記號(hào) ，置于空氣中晾干 ?？捎^察到薄 層板上經(jīng)光照后的偶氮苯溶液點(diǎn)樣處上端有兩個(gè)黃色斑點(diǎn) 哪一個(gè)斑點(diǎn)是順式的 ？ 哪一個(gè)斑點(diǎn) 是反式的 ？ 。計(jì)算異構(gòu)體的 rf 值。用上述相同的方法 ，采用 ethyl aceta

16、te : petroleum ether = 1:1為展開(kāi)劑， 對(duì)靛紅與偶氮苯的混合物進(jìn)行 tlc ， 為下面的柱層析選擇展開(kāi)劑 。c) 柱層析1 將層析柱固定在鐵架臺(tái)上 ， 一定要保持柱子豎直 。2 將層析柱洗凈后在柱底部放入一小團(tuán)脫脂棉花。3 在錐形瓶中稱重 7g 硅膠 sio2 ， 并用 ethyl acetate : petroleum ether(1:40) 調(diào)勻 。在層析柱的下方放置一個(gè)錐形瓶 ， 以收集流下的液體 。參加 少量洗脫劑于層析柱中 ，以潤(rùn)濕棉花 ， 使其貼在柱子下端 。4 翻開(kāi)層析柱活塞 ，控制溶劑下流 ，將硅膠懸濁液沿柱子側(cè)壁參加 ，并用 少量的溶劑洗去剩余的硅膠

17、，并參加柱中 。 用裝有橡皮管或塞子由下向 上輕輕敲擊柱子外壁 ，將氣泡趕出 ，使硅膠填裝均勻 。 并加壓使硅膠緊 密 ，以獲得較好的別離效果 。輕輕敲擊 ， 使硅膠最上層成均勻平面 ，然 后用藥匙沿柱子側(cè)壁 ，輕輕地、慢慢地在硅膠外表覆蓋一層海砂 注意 ：不要破壞硅膠 的上平面 。關(guān)閉活塞 ，備用 。5 翻開(kāi)活塞 ，當(dāng)溶劑液面降至海砂外表時(shí) ， 關(guān)閉活塞 。用滴管沿柱子側(cè)壁 參加靛紅與偶氮苯混合物的溶液 稱取 40 mg ，置于 1.5ml 的塑料樣品 管，參加 1 ml 二氯甲烷 ch2cl2 ，超聲振蕩使其溶解 。翻開(kāi)活塞 ， 使溶劑液面降至海砂外表 ， 關(guān)閉活塞 。 再用少量的展開(kāi)劑洗

18、塑料樣品管 ，參加層析譜 中， 并注意洗去粘附在柱壁上的液滴 ，翻開(kāi)活塞 ，流到液面 ，關(guān)閉活塞 。重復(fù)上述操作 ，直到 將所有化合物沖到硅膠里面 。6 沿側(cè)壁參加大量的洗脫劑 ethyl acetate : petroleum ether (1:40)， 翻開(kāi)活塞 ，加壓保持一定的流速 ， 觀察色帶的形成和別離 。7 當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí) ，并且沒(méi)有流出之前 ，關(guān)閉活塞 ，倒空錐形 瓶，翻開(kāi)活塞 ，收集全部色帶 。然后，改用 ethyl acetate : petroleum ether (1:1) 作為洗脫劑 。關(guān)閉活塞 ，換一個(gè)空的且干凈的錐形瓶 ， 翻開(kāi)活塞 。當(dāng)?shù)诙€(gè)有色帶到達(dá)柱

19、底時(shí) ，并且沒(méi)有流出之前 ， 關(guān)閉活塞 ，倒空錐形瓶 ，翻開(kāi)活塞 ， 收集全部色帶 。柱層析別離結(jié)束 。8 柱層析別離結(jié)束后 ，采用 tlc 對(duì)上述別離的兩個(gè)溶液進(jìn)行分析 ，總結(jié)分 離效果 。同時(shí) ，翻開(kāi)層析柱活塞 ，在加壓下讓展開(kāi)劑流干 ，然后將硅膠 倒入指定的固體廢物桶中 。 切勿倒入水槽或普通垃圾桶 。預(yù)習(xí)時(shí)的問(wèn)題1. 在薄層層析實(shí)驗(yàn)中 ， 為什么點(diǎn)樣的樣品斑點(diǎn)不可浸入展開(kāi)劑的溶液中？ 為什么進(jìn)行薄層層析時(shí)展缸要蓋上蓋 ？2. 當(dāng)用混合物進(jìn)行薄層層析時(shí) ， 如何判斷各組分的在薄層板上的位置 ？ 靛紅與偶氮 苯，哪一個(gè)的極性較強(qiáng) ？ 為什么 ？3. 柱層析時(shí)柱中假設(shè)留有空氣或者是填裝不均勻

20、， 對(duì)別離效果有何影響 ？如何防止 ？4. 偶氮苯和靛紅物理化學(xué)性質(zhì) ？毒性 ？有什么應(yīng)用 ？偶氮苯光照異構(gòu)化的機(jī)理 ？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它閱讀材料1. 光化學(xué)由光的作用引起的化學(xué)反響近年來(lái)日益受到人們的重視 ，光合作用就是最重要的光化學(xué) 反響 。研究激發(fā)態(tài)分子化學(xué)行為的光化學(xué)反響已經(jīng)成為有機(jī)化學(xué)的一個(gè)重要分支 。光不僅可以 引起多種多樣的化學(xué)反響 ， 合成各種前所未有的奇妙反響分子 ， 而且與我們的日常生活及生命 現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系 。2. 薄層色譜1. 固定相的選擇氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜常用

21、的固定相 。氧化鋁多用于別離堿性或中性有機(jī)物 ； 而 硅膠的吸附性源于外表的 si-oh 基，主要用于別離酸性 、 中性有機(jī)物質(zhì) 。薄層色譜用的硅膠有薄層色譜用的硅膠有60g 、6ogf254 、 60h 、 60hf254 和60hf254+366 等類型 ，其中 g 表示含有 13硫酸鈣作為黏合劑 ；h 表示不含硫酸鈣 ； f254 表示含有 2 無(wú)機(jī)熒光物質(zhì) ，在 254 nm 的紫外光照射下發(fā)出綠色熒光 。與硅膠相似 ， 氧化鋁也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁h、 氧化鋁 g、氧化鋁 hf254 和氧化鋁 gf254 等類型 。 黏合劑除硫酸鈣外 ，還可用淀粉 、 羧甲基纖維 素 c

22、mc) 。2. 操作方法 點(diǎn)樣在薄層板一端約 1cm 處， 用鉛筆輕輕劃一條作為起點(diǎn)線 。樣品用易揮發(fā)性溶劑溶解后 ， 用毛細(xì)管吸取樣品溶液 ， 輕輕接觸到起點(diǎn)線的某一位置上 。如果溶液太稀 ， 可多點(diǎn)幾次 ，但要 等第一次樣品溶劑揮發(fā)后 ， 再點(diǎn)第二次 。點(diǎn)好樣品后 ， 待溶劑揮發(fā)干凈 ，才可以進(jìn)行下面的展開(kāi)過(guò)程 。 展開(kāi)劑的選擇。由于硅膠和氧化鋁都選擇展開(kāi)劑，首先應(yīng)考慮對(duì)被別離物有一定的溶解度和解吸能力 是極性吸附劑，所以展開(kāi)劑的極性越大，試樣在薄板上移動(dòng)的距離越遠(yuǎn)，rf值rf值是一個(gè)化合物在薄層板上上升的高度與展開(kāi)劑上升的高度的比值越大。例如，在別離過(guò)程中常發(fā)現(xiàn) rf太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性

23、不夠，需要考 慮參加一種極性強(qiáng)的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控 。發(fā)現(xiàn)rf值太小，說(shuō)明展開(kāi)劑極性不夠， 需要考慮參加一種極性強(qiáng)的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。常用展開(kāi)劑的洗脫力由小到大的順序?yàn)椋菏兔?、環(huán)己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有機(jī)酸 等。此外，在展開(kāi)過(guò)程中，展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)劑的蒸氣須始終處于飽和狀態(tài)。一般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上下端浸于展開(kāi)劑中丨，蓋好密封一段時(shí)間。取放薄層板應(yīng)迅速。 顯色篇三：柱層析知識(shí)總結(jié)柱層析知識(shí)總結(jié) 小木蟲(chóng)金幣+1:獎(jiǎng)勵(lì)一下，鼓勵(lì)發(fā)有價(jià)值的話題xiazanwen金幣 +5:辛苦了 2022-08-24 06:34:58楓葉

24、子2006:編輯內(nèi)容2022-10-24 17:10柱層析利用層析柱將混合物各組分別離開(kāi)來(lái)的操作過(guò)程稱為柱層析。柱層析是層析技術(shù)中的一類，依據(jù)其作用原理又可分為吸附柱層析、分配柱層和離子交換柱層析等。其中以吸附柱層析應(yīng)用最廣。以下只介紹吸附柱層析的相關(guān)問(wèn)題，其操作方法也可作為其他類型柱層析的參考。1. 吸附柱層析的器材1層析柱實(shí)驗(yàn)室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管，活塞的芯最好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞，那么真 空油脂要小心地涂薄涂勻。另一種是將玻璃管下端拉細(xì)，套上一段彈性良好的管子。這段管子 必須是不能被淋洗劑溶解的，

25、普通橡皮管一般不可充作此用，因?yàn)橄鹌ひ妆宦确?、苯、thf等溶劑溶脹，而聚乙烯管子對(duì)大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、節(jié)省淋洗劑、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用日趨廣泛。薄膜塑料柱總 是以扁平成卷保存的，兩側(cè)常有很深的折痕。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊。將這段玻璃管穿過(guò)一個(gè)單孔塞。然后將薄膜管放進(jìn)一根又粗又長(zhǎng)，下端拉細(xì)了的玻璃管內(nèi)，使塞子塞緊大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個(gè)小孔即可使用。層析柱的尺寸根據(jù)被別離物的量來(lái)確定，其直徑與高度之比那

26、么根據(jù)被別離混合物的別離難易而定，一般在1 : 8到1 : 50之間。柱身細(xì)長(zhǎng)，別離效果好，但可別離的量小，且別離 所需時(shí)間長(zhǎng)；柱身短粗，別離效果較差，但一次可以別離較多的樣品，且所需時(shí)間短。如果待 別離物各組分較難別離，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子，如果要處理大量的較易別離的或?qū)e離純度要求 較低的混合物，那么可選用粗而短的柱子。最常使用的層析柱，直徑與長(zhǎng)度之比在 1 : 8到 1 : 15之間。(2) 吸附劑柱層析中最常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。其用量為被別離樣品的 3050倍，對(duì)于難以別離的混合物，吸附劑的用量可達(dá)100倍或更高。對(duì)于吸附劑應(yīng)綜合考慮其種類、酸堿 性、粒度及活性等因素，最后用實(shí)驗(yàn)方

27、法選擇和確定 。市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗到其 浸出液的ph值為4,適用于別離酸性物質(zhì)；堿性氧化鋁浸出液的 ph值為910,用以別離 胺類、生物堿及其他有機(jī)堿性化合物。中性氧化鋁的相應(yīng) ph值為7.5 ,適合于醛、酮、醌、酯等類化合物的別離以及對(duì)酸、堿敏感的其他類型化合物的別離。硅膠沒(méi)有酸堿性之分，可適用于各類有機(jī)物的別離。柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100150目，硅膠為60100目，如果顆粒太小，淋洗劑在其中流動(dòng)太慢，甚至流不出來(lái)。氧化鋁和硅膠的活性各分五個(gè)等級(jí)。哪個(gè)活性級(jí)別別離效果最好，要用實(shí)驗(yàn)方法確定， 而不是盲目選擇高的活性級(jí)別，最常使

28、用的是iiiii級(jí)。如果吸附劑活性太低，別離效果不好，可通過(guò)活化來(lái)提高其活性。所謂活化就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過(guò)程。通常是將吸附劑裝在瓷盤(pán)里放進(jìn)烘箱中恒溫加熱?；罨臏囟群蜁r(shí)間應(yīng)根據(jù)別離需要而定 。氧化鋁一般在200 C恒溫4h ,硅膠在105110 C恒溫0.5 1h?；罨戤?，切斷電源，待溫度降至接近室溫時(shí)，從烘箱中取出放進(jìn)枯燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中別離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，別離效果反而好一些。此外，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團(tuán)，對(duì)微弱的酸堿性都很敏感，那么可用纖維素、淀粉或糖類作吸附劑?；钚蕴际且环N吸附能力很高的吸附劑

29、，但因粒度太小而不常用。(3) 淋洗劑淋洗劑是將被別離物從吸附劑上洗脫下來(lái)所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡(jiǎn)稱溶劑。其極性大小和對(duì)被別離物各組分的溶解度大小對(duì)于別離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)大于被別離物的極性，那么淋洗劑將受到吸附劑的強(qiáng)烈吸附，從而將原來(lái)被吸附的待別離物頂替下來(lái)，隨多余的淋洗劑沖下而起不到別離作用；如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)小于各組分的極性，那么各組分被吸附劑強(qiáng)烈吸附而留在固定相中，不能隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，也不能到達(dá)別離的目的。如果淋洗劑對(duì)于被別離物各組分溶解度太大，被別離物將會(huì)過(guò)多、過(guò)快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地別離；如果溶解度太小，那么會(huì)造成譜帶分散，甚至完全不能分開(kāi)。

30、常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同，很多資料給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，首先在薄層層析板上試選 ，初步,反之確定后再上柱別離。如果所有色帶都行進(jìn)甚慢那么應(yīng)改用極性較大溶解性能也較大的溶劑 那么改用極性和溶解性都較小的溶劑，直至獲得滿意的別離效果。除了別離效果外還應(yīng)當(dāng)考慮：在常溫至沸點(diǎn)的溫度范圍內(nèi)可與被別離物長(zhǎng)期共存不發(fā) 生任何化學(xué)反響，也不被吸附劑或被別離物催化而發(fā)生自身的化學(xué)反響；沸點(diǎn)較低以利回收；毒性較小，操作平安；適當(dāng)考慮價(jià)格是否合算，來(lái)源是否方便；回收溶劑一般不 應(yīng)作為最終純化產(chǎn)物的淋洗劑。淋洗劑的用量往往較大，故最好

31、使用單一溶劑以利回收。只有在選不出適宜的單一溶劑時(shí)才使用混合溶劑?；旌先軇┮话阌蓛煞N可以無(wú)限混溶的溶劑組成，先以不同的配比在薄層板上試驗(yàn)，選出最正確配比，再按該比例配制好，像單一溶劑一樣使用。如果必須在層析過(guò)程中 改變淋洗劑的極性，不能把一種溶劑迅速換成另一種溶劑，而應(yīng)當(dāng)將極性稍大的溶劑按一定的百分率逐漸加到正在使用的溶劑中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)律稱為 冪指數(shù)增加，例如，原淋洗劑為環(huán)己烷，如欲參加二氯甲烷以增加其極性，那么不應(yīng)立即換為二氯甲烷，而應(yīng)使用這兩種溶劑的混合液，其中二氯甲烷的比例依次為 5%, 15%，45%，最后再換為純潔的二氯甲烷。每次加大比例后，須待流

32、出液量為吸附劑裝載體積的3倍時(shí)再進(jìn)一步加大比例。這只是一般方法，其目的在于防止后面的色帶行進(jìn)過(guò)快，追上前面的色帶，造成交叉帶。但如果兩色帶間有很寬闊的空白帶，不會(huì)造成交叉，那么亦可直接換成后一種溶劑，所以應(yīng)根據(jù)具體情況靈活運(yùn)用。(4) 被別離的混合物在實(shí)際工作中，被別離的樣品是不能選擇的，但認(rèn)真考察各個(gè)組分的分子結(jié)構(gòu) ，估計(jì)其 吸附能力，對(duì)于正確選擇吸附劑和淋洗劑都是有益的。假設(shè)化合物的極性較大，或含有極性較大的基團(tuán)，那么易被吸附而較難被洗脫 ，宜選用吸附力較弱的吸附劑和極性較大的淋洗劑。反之，對(duì)于極性較小的樣品那么選用極性較強(qiáng)的吸附劑和弱極性或非極性淋洗劑。假設(shè)各組分極性差異較大，那么易于別

33、離，可選用較為短粗的柱子，使用較少的吸附劑；假設(shè)各組分極性相差甚 微，那么難于別離，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子并使用較大量的吸附劑 。(5) 其他物品儲(chǔ)存淋洗劑的分液漏斗一只，接收洗出液的錐形瓶假設(shè)干只，其容積大小根據(jù)淋洗劑的體積確定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗凈烘干。假設(shè)層析柱很小，也可用少量脫脂棉代替 玻璃毛。2. 吸附柱層析的操作裝柱裝柱的方法分濕法和干法兩種。濕法裝柱時(shí)，將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞，參加選定的淋洗劑至柱容積的 1/4 ，用一支干凈的玻璃棒將少量玻璃毛(或脫脂棉)輕輕推入柱底狹窄部位，小心擠出其中的氣泡，但不要壓得太緊密，否那么淋洗劑將流出太慢或根本流不出來(lái)。將準(zhǔn)備好的白沙

34、參加柱中，使在玻璃毛上均勻沉積成約5mm厚的一層。將需要量的吸附劑置燒杯中，加淋洗劑浸潤(rùn)，溶脹并調(diào)成糊狀。翻開(kāi)柱下活塞調(diào)節(jié)流出速度為每秒鐘1滴，將調(diào)好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩注入柱中，同時(shí)用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身，使吸附劑在淋洗劑中均勻沉降，形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑最好一次加完。假設(shè)分?jǐn)?shù)次加，那么會(huì)沉積為數(shù)層，各層交接處的吸附劑顆粒甚細(xì)，在別離時(shí)易被誤認(rèn)為是一個(gè)色層。全部吸附劑加完后，在吸附劑沉積面上蓋一層白沙如柱很小，也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片，關(guān)閉活塞。在全部裝柱過(guò)程及裝完柱后，都需始終保持吸附劑上面有一段液柱，否那么將會(huì)有空氣進(jìn)入吸附劑，在其中形成氣泡

35、而影響別離效果。如果發(fā)現(xiàn)柱中已經(jīng)形成了氣泡，應(yīng)設(shè)法排除，假設(shè)不能排除，那么應(yīng)倒出重裝。裝好的吸附柱各層材料的分布見(jiàn)圖3-36。干法裝柱時(shí)，先將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞。參加溶劑至柱容積的 3/4，翻開(kāi) 活塞控制溶劑流速為1滴/秒，然后將所需量的吸附劑通過(guò)一支短頸玻璃漏斗慢慢參加柱中，同時(shí)，輕輕敲柱身使柱填充緊密。干法裝柱的缺點(diǎn)是容易使柱中混有氣泡。特別是使用硅膠為吸附劑時(shí)，最好不用干法裝柱，因?yàn)楣枘z在溶劑中有一溶脹過(guò)程，假設(shè)采用干法裝柱，硅膠會(huì)在柱中溶脹，往往留下縫隙和氣泡，影響別離效果，甚至需要重新裝柱。裝填薄膜塑料柱時(shí)，可先用抽氣法將薄膜展開(kāi)成圓柱形，在底部裝入一段玻璃毛，吸附劑通過(guò)

36、一個(gè)粗頸漏斗自柱頂裝入。裝至1/3處，將柱身在堅(jiān)硬的外表上礅結(jié)實(shí)，再裝入1/3，再礅結(jié)實(shí)，直至裝到需要的高度。裝成的薄膜柱應(yīng)緊密結(jié)實(shí)，可以像玻璃柱那樣用夾子 夾住，再在其底部扎一些小孔即可使用。2加樣加樣亦有干法、濕法兩種。濕法加樣是將待別離物溶于盡可能少的溶劑中，如有不溶性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)濾去。翻開(kāi)柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處，關(guān)閉活塞，將配好的溶液沿著柱內(nèi)壁緩緩參加，切記勿沖動(dòng)吸附劑，否那么將造成吸附劑外表不平而影響別離效果。溶液加完后，小心開(kāi)啟柱下活塞，放出液體至溶液液面降至濾紙片時(shí)，關(guān)閉活塞，用少許溶劑沖洗柱內(nèi)壁同樣不可沖動(dòng)吸附劑，再放出液體至液面降到濾紙?zhí)?，再次沖洗柱內(nèi)壁，直

37、至柱壁和柱頂溶劑沒(méi)有顏色。加樣操作的關(guān)鍵是要防止樣品溶液被沖稀。在技術(shù)熟練的情況下，也可以不關(guān)下部活塞，在每秒鐘1滴的恒定流速下連貫地完成上述操作。干法加樣是將待別離樣品加少量低沸點(diǎn)溶劑溶解，再參加約5倍量吸附劑，拌和均勻后在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)至干。揭去柱頂濾紙片，將吸附了樣品的吸附劑平攤在柱內(nèi)吸附劑的頂端，在上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙。干法加樣易于掌握，不會(huì)造成樣品溶液的沖稀，但不適合對(duì)熱敏感的化合物。3淋洗和接收樣品參加后即可用大量淋洗劑淋洗。隨著流動(dòng)相向下移動(dòng)，混合物逐漸分成假設(shè)干個(gè)不同的色帶，繼續(xù)淋洗，各色帶間距離拉開(kāi)，最終被一個(gè)個(gè)淋洗下來(lái)。當(dāng)?shù)谝簧珟ч_(kāi)始流出時(shí)， 更換接收瓶，接收完畢再更

38、換接受瓶，接受兩色帶間的空白帶，并依此法分別接收各個(gè)色帶。假設(shè)后面的色帶下行太慢，可依次使用幾種極性逐漸增大的淋洗劑來(lái)淋洗。為了減少添加淋洗劑的次數(shù)，可用分液漏斗在柱頂“自動(dòng)添加。分液漏斗的活塞翻開(kāi)，頂塞密封，尾部插進(jìn)柱上部的淋洗劑液面以下，當(dāng)液面下降后，漏斗尾部露出，即有空氣泡自尾部進(jìn)入分液漏斗，這就加大了漏斗內(nèi)液面上的壓力 ，漏斗內(nèi)的淋洗劑就自動(dòng)流入柱內(nèi)，使柱內(nèi)液面上升，當(dāng)液面淹沒(méi)漏斗尾部時(shí)，就不再有空氣進(jìn)入漏斗，漏斗內(nèi)的淋洗劑就不再流出。在使用薄膜塑料柱進(jìn)行層析時(shí)，一旦色帶形成并拉開(kāi)距離，可將柱吸干，用刀沿空白帶處切開(kāi)，將各色帶分別萃 取，各自蒸去溶劑，即得到相應(yīng)組分的化合物。顯色別離無(wú)

39、色物質(zhì)時(shí)需要顯色。如果使用帶螢光的吸附劑，可在黑暗的環(huán)境中用紫外光照射 以顯出各色帶的位置，以便按色帶分別接收。但柱上顯色遠(yuǎn)不如在薄層板上顯色方便。所以常用的方法是等分接收，即事先準(zhǔn)備十幾個(gè)甚至幾十個(gè)接收瓶，依次編出號(hào)碼，各接收相同體積 的流出液，并各自在薄層板上點(diǎn)樣展開(kāi)，然后在薄層板上顯色(相關(guān)的顯色操作見(jiàn)薄層層析部分)。具有相同r f值的為同一組分，可以合并處理。也可能出現(xiàn)交叉帶，假設(shè)交叉帶很少， 可以棄之，假設(shè)交叉帶較多，或樣品很貴重，可以將交叉局部再次作柱層析別離，直至完全分開(kāi)。3. 柱層析操作中應(yīng)注意的問(wèn)題(1) 要控制淋洗劑流出的速度 。一般控制流速為1滴/秒。假設(shè)流速太快，樣品在

40、柱中的 吸附和溶解過(guò)程來(lái)不及到達(dá)平衡，影響別離效果。假設(shè)流速太慢，別離時(shí)間會(huì)拖得太長(zhǎng)。有 時(shí)，樣品在柱中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能促成某些成分發(fā)生變化?；蛄鲃?dòng)相在柱中下行速度小于 樣品的擴(kuò)散速度，會(huì)造成色帶加寬、交合甚至根本不能別離。(2) 以下現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響別離效果，必須盡力防止。a. 色帶過(guò)寬，界限不清。造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當(dāng)，或吸附劑、淋洗劑選擇不當(dāng)，或樣品在柱中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。但更常見(jiàn)的卻是在加樣時(shí)造成的。假設(shè)在樣品溶液加進(jìn)柱中后，沒(méi)有翻開(kāi)下部活塞放出淋洗劑使樣品溶液降至濾紙片處，即急于加溶劑沖洗柱壁，造成樣品溶液大幅度稀釋，或過(guò)早加大量溶劑淋洗， 必然會(huì)造成色帶過(guò)寬。所以溶樣

41、時(shí)一定要使用盡可能少的溶劑 ，加樣時(shí)一定要防止 樣品溶液的稀釋。b. 色帶傾斜。正常情況下柱中的色帶應(yīng)是水平的，而傾斜的色帶，在前一個(gè)色帶尚未完全流出時(shí)，后面色帶的前沿已開(kāi)始流出，所以不能接收到純粹的單一組分。造成色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜，或柱身安裝得不垂直。c. 氣泡。造成氣泡的原因可能是玻璃毛或脫脂棉中的空氣未擠凈，其后升入吸附劑中形成氣泡，也可能是吸附劑未充分浸潤(rùn)溶脹，在柱中與淋洗劑作用發(fā)熱而形成，但 更大量的是在裝柱或淋洗過(guò)程中淋洗劑放出過(guò)快，液面下降到吸附劑沉積面之下，使空氣進(jìn)入吸附劑內(nèi)部滯留而成。當(dāng)柱內(nèi)有氣泡時(shí)，大量淋洗劑順氣泡外壁流下，在氣泡下方形成溝流，使后一色帶前

42、沿的一局部突出伸入前一色帶，從而使兩色帶難于別離。所以在裝柱及淋洗過(guò)程中應(yīng)始終保持吸附劑上面有一段液柱。d. 柱頂面填裝不平。這時(shí)色帶前沿將沿低凹處向下延伸進(jìn)入前面的色帶，這也是一種溝流。e. 斷層和裂縫。當(dāng)柱內(nèi)某一區(qū)域內(nèi)積有較多氣泡時(shí)，這些氣泡會(huì)合并起來(lái)在柱內(nèi)形成斷層或裂縫。裂縫造成的溝流，而斷層相當(dāng)于一個(gè)不平整的裝載面。1語(yǔ)源學(xué)2類別3根本原理4幾種常用的層析語(yǔ)源學(xué)chrome意為色彩 graphy 源自希臘文，意為寫(xiě)。色譜為層析的同義語(yǔ)，都是從 英語(yǔ) chromatography 譯來(lái)的。層析色譜chromatograpby在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體外表的液體作為固定相，把液體與上

43、述液體不相混合的或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài) 邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此別離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二 種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土 和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w，也可使用其他物質(zhì)。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析column chromatogra-phy丨，在玻璃板上涂上一層薄而均的物質(zhì)作為固定相的稱為薄層層析thin-layerchroma

44、tography ，篇四：凝膠層析試驗(yàn)報(bào)告摘要凝膠色譜技術(shù)是六十年代初開(kāi)展起來(lái)的一種快速而又簡(jiǎn)單的別離分技術(shù)，由于設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，不需要有機(jī)溶劑，對(duì)高分子物質(zhì)有很高的別離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。根據(jù)別離的對(duì)象是水溶性的化合物還是有機(jī)溶劑可溶物，又可分為凝膠過(guò)濾色譜gfc和凝膠滲透色譜 gpc。gfc 一般用于別離水溶性的大分子，如多糖類化合物。本實(shí)驗(yàn)用凝膠色譜法對(duì)食用油中的甘油三酯進(jìn)行了別離提取。關(guān)鍵詞：凝膠色譜甘油三酯食用油第一章簡(jiǎn)介凝膠層析法凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比擬溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范

45、圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)別離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的別離效果。一、凝膠的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種別離又稱組別別離，一般可選用sephadex g-25 和g-50 ，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)1000-5000 的脫鹽可使用sephadex g-10，g-15 及bio-gel-p-2 或4。如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘葦M 近似的物質(zhì)進(jìn)行別離 ， 這種別離又叫分級(jí)別離 。 一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物 質(zhì)的凝膠 ，層析過(guò)程中這些物質(zhì)都能不同

46、程度地深入到凝膠內(nèi)部 ， 由于 kd 不同 ，最后得到別 離。二 、 柱的直徑與長(zhǎng)度根據(jù)經(jīng)驗(yàn) ，組別別離時(shí) ，大多采用 2-30cm 長(zhǎng)的層析柱 ， 分級(jí)別離時(shí) ，一般需要 100cm 左右長(zhǎng)的層析柱 ， 其直徑在 1-5cm 范圍內(nèi) ， 小于 1cm 產(chǎn)生管壁效應(yīng) ， 大于 5cm 那么稀釋現(xiàn)象 嚴(yán)重。長(zhǎng)度I與直徑d的比值l/d 般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40 之間。三、凝膠柱的制備凝膠型號(hào)選定后 ， 將干膠顆粒懸浮于 5-10 倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹 ， 溶脹之 后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去 。 自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng) ， 加熱可使溶脹加速 ， 即在沸水浴中將濕凝膠 漿逐

47、漸升溫至近沸 ， 1-2 小時(shí)即可到達(dá)凝膠的充分脹溶 。 加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒 。凝膠的裝填 ：將層析柱與地面垂直固定在架子上 ， 下端流出口用夾子夾緊 ，柱頂可安裝 一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器 ，柱內(nèi)充滿洗脫液 ， 將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜?中， 然后在微微地?cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi) ， 這樣凝膠粒水平上升 ，直到所需高度為止 ，撤除 柱頂裝置 ，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床外表 。 稍放置一段時(shí)間 ， 再開(kāi)始流動(dòng)平衡 ， 流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速 。在平衡過(guò)程 中逐漸增加到層析的流速 ， 千萬(wàn)不能超過(guò)最終流速 。 平衡凝膠床過(guò)夜 ， 使用前要檢查層析床是 否均勻 ， 有

48、無(wú)“紋路或氣泡 ， 或加一些有色物質(zhì)來(lái)觀察色帶的移動(dòng) ， 如帶狹窄 、均勻平整說(shuō) 明層析柱的性能良好 ， 色帶出現(xiàn)歪曲 、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱 。四、加樣和洗脫凝膠床經(jīng)過(guò)平衡后 ，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和 ， 再用滴管參加樣品 。 一 般樣品體積不大于凝膠總床體積的5-10 。 樣品濃度與分配系數(shù)無(wú)關(guān) ， 故樣品濃度可以提高， 但分子量較大的物質(zhì) ， 溶液的粘度將隨濃度增加而增大 ， 使分子運(yùn)動(dòng)受限 ， 故樣品與洗脫 液的相對(duì)粘度不得超過(guò) 1.5-2 。 樣品參加后翻開(kāi)流出口 ，使樣品滲入凝膠床內(nèi) ， 當(dāng)樣品液面 恰與凝膠床外表相平時(shí) ， 再參加數(shù)毫升洗脫液中洗管壁 ， 使其全

49、部進(jìn)入凝膠床后 ， 將層析床與 洗脫液貯瓶及收集器相連 ， 預(yù)先設(shè)計(jì)好流速 ， 然后分部收集洗脫液 ，并對(duì)每一餾份做定性 、 定 量測(cè)定 。五、凝膠柱的重復(fù)使用 、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用 ， 不必特殊處理 ， 并不影響別離效果 。 為了防止凝膠染菌 ， 可 在一次層析后參加 0.02 的疊氮鈉 ， 在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去 ， 以免干擾洗脫液的測(cè) 定。 如果不再使用可將其回收 ， 一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干 ，依次用 70 、 90 、95乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá) 90以上， 濾干， 再用乙醚洗去乙醇 、濾干、枯燥保 存。 濕態(tài)保存方法是凝膠漿中參加抑菌劑或水沖洗到中性

50、，密封后高壓滅菌保存 。六、凝膠層析的應(yīng)用1. 脫鹽：高分子 如蛋白質(zhì) 、核酸、多糖等 溶液中的低分子量雜質(zhì) ，可以用凝膠層 析法除去 ， 這一操作稱為脫鹽 。本法脫鹽操作簡(jiǎn)便 、快速 、 蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽 過(guò)程中不易變性 。適用的凝膠為 sephadexg-10、 15 、 25 或 bio-gel-p-2 、4 、 6。柱長(zhǎng)與直徑之比為 5-15 ，樣品體積可達(dá)柱床體積的 25-30 ， 為了防止 蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上， 一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡 ，然后參加樣品 ， 再用同樣緩沖液洗脫 ，收集的洗脫液用冷凍枯燥 法除去揮發(fā)性鹽類 。2. 用于別離

51、提純 ：凝膠層析法已廣泛用于酶 、蛋白質(zhì)、氨基酸 、多糖、激素、生 物堿等物質(zhì)的別離提純 。凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力 ， 可用來(lái)去除無(wú)離子水中的致熱原 制備注射用水 。3. 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量 ： 用一系列分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)， 在同一條件下層析 ，記錄每一分鐘成分的洗脫體積， 并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線 ，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 測(cè)定未知物質(zhì)的分子 量時(shí) ，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗腫后 ，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積 ， 在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量 。4. 高分子溶液的濃縮 ： 通常將 sephadexg-25 或 50 干膠投入到稀的高

52、分子溶液 中 ， 這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中 ，而高分子物質(zhì)那么 排阻在凝膠顆粒之外 ， 再經(jīng)離心或過(guò)濾 ，將溶脹的凝膠別離出去 ，就得到了濃縮的 高分子溶液 。第二章 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)從粗油中別離甘油三酯 ，學(xué)習(xí)運(yùn)用凝膠色譜法別離油脂中各個(gè)成分的方 法 。二、實(shí)驗(yàn)原理 吸附色譜是利用吸附劑對(duì)被別離物質(zhì)的吸附能力不同 ， 用溶劑或氣體洗脫 ， 以使組分別 離。常用的吸附劑有氧化鋁 、硅膠 、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì) 。硅 膠色譜頻繁使用在脂質(zhì) 中的單一脂質(zhì) ，糖脂質(zhì)以及磷脂質(zhì)的別離 。各種脂質(zhì)被硅 膠吸附 ，隨著洗脫溶液的極性增 加， 各種極性不同的化合物被

53、別離出來(lái) 。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑正己烷 200ml 、乙醚 15ml 、蒸餾水 1.3ml 、硅膠100 目左右 25g四、實(shí)驗(yàn)儀器層析柱(1.5 x 75cm)、250ml三角容量瓶、分析天平0.001g丨、真空濃縮裝置 、 搜集瓶五 、 實(shí)驗(yàn)提取工藝流程1. 活化硅膠 110 度 ， 6 小時(shí)枯燥 25g 中參加 5%蒸餾水使其局部鈍化并充分混勻 放置 30 分鐘。參加正己烷至剛好淹沒(méi)硅膠為止并用超聲波脫氣 3 分鐘。2. 層析柱底部放入脫脂棉少許 防止硅膠泄漏 ， 將硅膠放入到層析柱中正己烷溶液 要沒(méi)過(guò)硅膠層外表 。3. 準(zhǔn)確稱取食用油 1±0.001 g參加到硅膠層析柱中用 1

54、50ml 正己烷/ 乙醚87 : 13 , v/v洗脫，洗脫速度為2-3滴/min 。洗脫時(shí)外表不能干和。4. 收集的洗脫液用真空濃縮裝置濃縮至無(wú)有機(jī)溶劑氣味為止 。5. 準(zhǔn)確稱取濃縮物質(zhì)量篇五 ： 實(shí)驗(yàn)一 柱色譜實(shí)驗(yàn)一 柱色譜 、 薄色譜一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 、 了解色譜法別離提純有機(jī)化合物的根本原理和應(yīng)用 。2 、 掌握柱層析 、 薄層層析的操作技術(shù) 。二、實(shí)驗(yàn)原理色譜法 chromatography 亦稱色層法 、 層析法等 。色譜法是別離 、 純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一 。色譜法的根本原理是利用混合 物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能 分配 的不同 ，或其親和性的差異 ， 使混合物

55、的溶 液流經(jīng)該種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用 ， 從而使各組分別離 。色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用主要包括以下幾方面 :1 、別離混合物 一些結(jié)構(gòu)類似 、 理化性質(zhì)也相似的化合物組成的混合物，一般應(yīng)用化學(xué)方法別離很困難 ，但應(yīng)用色譜法別離 ，有時(shí)可得到滿意的結(jié)果 。2 、 精制提純化合物 有機(jī)化合物中含有少量結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì) ， 不易除去 ，可利用色譜 法別離以除去雜質(zhì) ，得到純品 。3 、 鑒定化合物在條件完全一致的情況 ， 純碎的化合物在薄層色譜或紙色譜中都呈現(xiàn)一定的移 動(dòng)距離 ， 稱比移值 rf 值 ， 所以利用色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩 種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì) 。 但影響比

56、移值的因素很多 ， 如薄層的厚度 ， 吸附劑顆粒 的大小 ， 酸堿性 ， 活性等級(jí) ， 外界溫度和展開(kāi)劑純度 、組成、揮發(fā)性等 。 所以 ， 要獲得重現(xiàn)的 比移值就比擬困難 。為此 ， 在測(cè)定某一試樣時(shí) ， 最好用樣品進(jìn)行對(duì)照 。4 、觀察一些化學(xué)反響是否完成，可以利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點(diǎn)的逐步消失 ，以證明反響完成與否 。吸附色譜主要是以氧化鋁 、 硅膠等為吸附劑 ， 將一些物質(zhì)自溶液中吸附到它的外表上 ， 而后用溶劑洗脫或展開(kāi) ， 利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附作用 ， 和它們?cè)谌軇┲胁煌?溶解度 ， 也就是利用不同化合物在吸附劑上和溶液之間分布情況的不同而得到別離 。 吸附色譜別離可采用柱色譜和薄層色譜兩種方式 。柱