Zmp1的克隆表達及其對巨噬細(xì)胞的影響

1、Zmp1的克隆表達及其對巨噬細(xì)胞的影響目 的：構(gòu)建分枝桿菌鋅離子依賴的金屬蛋白酶1(zmp1) 基因的原核表達載體 , 在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達 , 對 Zmp1重組融合蛋白進行純化；構(gòu)建分枝桿菌 zmpl 基因與增強型的綠色熒光蛋白 (EGFP)融合的真核表達載體 , 驗證其在RAW264.7細(xì)胞中的表達；探討Zmpl 蛋白對 RAW264.7細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及吞噬體- 溶酶體融合的影響。方法：1. 以卡介苗 (BCG)基因組DNA為模板 , 采用 PCR法擴增 zmp1基因；定向克隆到原核表達載體pET-32a(+)的多克隆位點中 , 構(gòu)建重組原核表達載體p

2、ET-32a(+)-zmpl ；轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)表達 , 純化獲取 Zmpl 重組蛋白 , 表達產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE和 Westernblot 鑒定。 2. 以 BCG基因組 DNA為模板 , 采用 PCR法擴增 zmp1基因；定向克隆到真核表達載體 pEGFP-N1的多克隆位點中 , 構(gòu)建重組真核表達載體 p EGFP-N1-zmpl,并轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞 , 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達 , 實時定量 PCR(qRT-PCR)檢測 zmpl 基因 mRNA的表達水平。3. 用 Zmpl 重組蛋白作用 RAW264.7細(xì)胞后 24h, CCK

3、-8 法檢測細(xì)胞的增殖活力；作用后 48 h, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡4. 將載體 pEGFP-N1-zmpl瞬時轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞后 24h,CCK-8 法檢測細(xì)胞的增殖活力；轉(zhuǎn)染后48 h, 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和凋亡。5. 減毒鼠傷寒沙門氏菌 (SL7207) 感染RAW264.7細(xì)胞 ( 已轉(zhuǎn)染載體 pEGFP-N1-Zmpl或 Zmpl 重組蛋白作用 ), 采用沙門氏菌熒光抗體和溶酶體相關(guān)膜蛋白標(biāo)志物熒光抗體雙標(biāo)記, 通過熒光顯微鏡觀察Zmpl 蛋白阻止吞噬體 - 溶酶體融合的作用。 結(jié)果：1.PCR法擴增出 zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的原核表達載體pET一 32

4、a(+)-zmpl 經(jīng)雙酶切及基因測序鑒定構(gòu)建正確；經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達出重組 Zmpl 融合蛋白 , 相對分子量約為 94 kDa, 大小與預(yù)期融合蛋白相符；Western blot結(jié)果顯示重組 Zmpl 融合蛋白可與 His 標(biāo)簽單克隆抗體特異性結(jié)合。2.PCR法擴增出 zmp1基因；定向克隆構(gòu)建的真核表達載體pEGFP-N1-zmpl,經(jīng)雙酶切及基因測序鑒定構(gòu)建正確；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細(xì)胞中觀察到綠色熒光表達； qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1-zmpl的 RAW264.7田胞 zmp1的表達顯著升高。 3. 采用 Zmpl 重組蛋白

5、細(xì)胞外作用RAW264.7細(xì)胞 , 在 24-96 h 觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降； 細(xì)胞周期在 S 期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率和晚期細(xì)胞凋亡率均有所增加。 4. 將載體 pEGFP-N1-zmpl轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞 , 在 4896 h 觀察到細(xì)胞增殖活力有所下降；細(xì)胞周期在S 期和 G2期被阻滯；早期細(xì)胞凋亡率有所增加。5.Zmpl 重組蛋白組和 pEGFP-N1-zmpl細(xì)胞轉(zhuǎn)染組 , 雙熒光融合數(shù)量變化不大,影響吞噬體 - 溶酶體融合差異不明顯。 結(jié)論：1. 成功構(gòu)建了 zmpl 基因原核表達載體 , 并在大腸桿菌 BL21(DE3)中獲得重組 Zmpl 融合蛋白表達。 2. 成功構(gòu)建了 zmp1基因真核表達載體 , 并在 RAW264.7細(xì)胞中獲得重組 Zmpl 融合蛋白