prtP編碼的細胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌粘附及免疫作用的影響

1、prtP 編碼的細胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對干酪乳桿菌粘附及免疫作用的影響干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)屬于乳桿菌屬 (Lactobacillus),是可用于保健食品的益生菌 , 能夠耐受人體的防御機制, 其中包括口腔中的酶、 胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等。 干酪乳桿菌具有促進細胞分裂, 產(chǎn)生抗體免疫及預(yù)防癌癥等生理功能。由于干酪乳桿菌對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效, 現(xiàn)成為人們研究、開發(fā)、生產(chǎn)的焦點。 最新研究發(fā)現(xiàn) , 在乳酸乳球菌中 , 細胞外膜的絲氨酸蛋白酶 lactocepin能介導(dǎo)乳酸菌的黏附作用, 而且在某些乳酸菌中 ,lact

2、ocepin 對腸道炎性具有良好的抑制作用。它能夠降解部分炎性細胞因子。 因此對這種細胞表面蛋白的深入研究不但可以提高益生菌的益生功能, 且可為開發(fā)腸道免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論基礎(chǔ)。1 干酪乳桿菌 21858prtP 基因突變株構(gòu)建及其生物學(xué)特征。根據(jù) GenBank信息 , 細胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin由 prtP 基因編碼 , 本文通過通過 -Red重組技術(shù) , 替換干酪乳桿菌prtP 基因 , 構(gòu)建干酪乳桿菌 (21858)prtP基因突變株(21858 ) 。通過測定兩株乳酸菌的基本生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)21858和 21858 生長曲線類似 ,21858 自凝聚率在各個時間點都低于2

3、1858, 且時間越長差距越明顯。 21858與四種致病菌的共凝聚率大于21858。21858的疏水率為為44.1 ± 1.5%, 大于 21858 疏水率 23.9 ±0.62%, 且具有顯著差異 (P<0.05)。對致病菌的抑制效果21858 好于 21858, 但都沒明顯差異 (P>0.05)。提示 prtP 基因?qū)Ω衫胰闂U菌生長曲線無影響, 敲除 prtP 基因會降低干酪乳桿菌的自凝聚率和與治病菌的共凝聚率, 會提升疏水率 , 對致病菌抑制性有降低趨勢。 2 21858prtP 基因突變株 21858粘附能力研究通過建立體內(nèi)外粘附模型測定

4、 21858 和 21858對腸粘液、細胞及小鼠腸道的粘附能力。結(jié)果顯示 21858 小腸粘液粘附率4.638 ±2.3%,21858小腸粘液粘附率3.665 士 4.5%, 具有顯著差異 (P<0.05)。通過細胞粘附模型發(fā)現(xiàn)21858 對三種細胞的粘附性都大于21858。21858 和 21858對脾臟細胞的粘附?jīng)]有顯著差異(P>0.05),對小腸上皮細胞和巨噬細胞的粘附性有顯著差異(P<0.05)。采用流式細胞技術(shù)分析乳酸菌在體內(nèi)粘附情況 , 發(fā)現(xiàn)在小鼠的十二指腸、空腸、回腸中21858 的粘附率高于21858, 但是在結(jié)腸中 2185

5、8粘附率要高于 21858, 且在灌胃后 21858在腸道各個部位粘附菌數(shù)都隨時間存在一定上升趨勢。但兩株菌在空腸內(nèi)隨著時間有明顯下降趨勢。且發(fā)現(xiàn)回腸中總粘附菌數(shù)高于小腸其他部位。提示 prtP 基因編碼的細胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin,能夠提高干酪乳桿菌對小腸粘液、細胞表面以及小鼠腸道的粘附。 3.21858prtP 基因突變株 21858免疫效力研究研究發(fā)現(xiàn)21858 能提升小鼠體重 , 且與對照組有顯著差異(P<0.05),21858對體重的提升效果好于21858, 時間越長效果越明顯。21858 和 21858對免疫器官的指數(shù)有特異性影響。21858 和 218

6、58對胸腺指數(shù)在短期內(nèi) (10d) 沒有顯著影響 (P>0.05),但在較長期 (20 d),21858和21858高劑量組相對于對照組都有顯著差異(P<0.05),而其他各組相對于對照組無顯著差異。且高劑量組胸腺指數(shù)相對中劑量組有顯著差異, 提示干酪乳桿菌對胸腺指數(shù)影響存在劑量依賴關(guān)系。對于脾臟指數(shù), 兩種干酪乳桿菌在整個喂養(yǎng)階段都有提高的作用 , 且提升效果具有濃度依賴性, 濃度越高 , 提升越明顯。21858 提升效果優(yōu)于 21858。說明 21858 對免疫器官的影響要優(yōu)于21858。對免疫細胞研究發(fā)現(xiàn)21858 和 21858在飼喂的整個階段均能提高小鼠淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率 , 且在相同時間和劑量下21858 組的轉(zhuǎn)化率高于 21858組。對巨噬細胞的活化研究提示21858 能通過提高巨噬細胞的能量代謝水平或吞噬能力來活化巨噬細胞 , 增強其對抗原的處理能力。但 21858對巨噬細胞的活化沒有明顯提升作用 , 提示 21858 活化巨噬細胞能力要強于 21858。本研究通過流式細胞儀對小鼠 CD11c+,CD80+雙陽性脾淋巴細胞進行檢測。結(jié)果表明 , 兩種受試乳酸菌在喂養(yǎng)小鼠的整個階段均可持續(xù)提高CD11c+C