實時熒光定量PCR原理和實驗

1、實時熒光定量PCR原理和實驗 所屬分類:基因檢測.更多見 無論是對遺傳?。ㄈ绲刂泻Ｘ氀脱巡。?、傳染?。ㄈ绺窝缀桶??。┗蚰[瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對基因表達(dá)水平的影響， 或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實時熒光定量。該技術(shù)借 助于熒光信號來檢測 PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方 面還可以做到 PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴(kuò)增 曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)， 做到了真正意義上的 DNA定量。這是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量 PCR可以分為相對定量和 絕對定

2、量 兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個 樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上 更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉， 實驗設(shè)計更為簡便。在選擇實驗方案時要根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯?shù)據(jù)精度的要求來決定。定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統(tǒng)計學(xué)要求并對 數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實驗和設(shè)立內(nèi) 對照非常重要。由于各種各樣的客觀原因， 這一點在實踐中往往

3、 被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實驗一樣，定量 PCR也要設(shè)立陰性和陽性對照，以監(jiān)控試劑和實驗操作方面可能 出現(xiàn)的問題。1為什么終點定量不準(zhǔn)確？我們都知道理論上 PCR是一個指數(shù)增長的過程，但是實際 的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效 率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互 作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺期的時機(jī)和平臺期的高低 都有很大變化，難以精確控制。所以

4、，即使是重復(fù)實驗，各種條 件基本一致，最后得到的 DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動 很大（圖1 ）。圖1同一個樣本重復(fù)96次PCR的擴(kuò)增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的 光密度掃描等，測定的都是 PCR的終產(chǎn)物，而不是起始 DNA拷 貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系， 所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始 DNA拷貝數(shù)。對于絕大多數(shù)實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測等， 需要測定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過 PCR擴(kuò)增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實情況。在這種情 況下，就不能采用終點定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起

5、始拷貝 的數(shù)量。2為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？CT值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入 指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 從圖1的重復(fù)實驗中可 以直觀地看到，盡管平臺期 DNA拷貝數(shù)波動很大，CT值卻是相 對固定的。如果用不同濃度的 DNA作PCR,可以看出DNA濃度 越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環(huán)。 CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡便，以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增 加修正項。這些修正項的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。一般，我們有 Rn=RB+X0(1+EX

6、)nRS,也就是說第n次PCR 循環(huán)時的熒光信號強(qiáng)度(R n)等于背景信號強(qiáng)度(RB)加上每個分 子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS)與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán) 次數(shù)n = CT 時，則有 RT=RB+X0(1+EX)CTRS。兩邊取對數(shù)， 得 log(RT -RB) = logXO + CTIog(1+ Ex) + logRs。整理此式，CTIog(1+ Ex) = - logX0 + log(RT -RB)-logRs._ bg 用占 i b- log %1 = 一噸+巧)陶(“E工)所以對于每一個特定的 PCR反應(yīng)來說，EX、RT、RB和RS 都是常數(shù)，所以CT值與log X0成反比，也就

7、是說，CT值與起 始模板拷貝數(shù)(X0)的對數(shù)成反比，起始 DNA濃度每增加1倍， CT值減小1個循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點定量則比較粗放。如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè) PCR的效率(即Ex)為 100%，從上式推算出定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和 CT值的 最佳范圍。3怎樣確定CT值？實驗操作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計 學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時所對應(yīng)的 PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）?！盎€上 方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn) 偏差的10倍。閾值所在的橫線與 PCR擴(kuò)增曲線的交點所指的 PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定義是從第 3

8、個循環(huán)起到 CT值前3個循環(huán)止，其終點要根據(jù)每次實驗的具體數(shù)據(jù)調(diào)整， 一般取第3到第15個循環(huán)之間。早于3個循環(huán)時，熒光信號很 弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開 始增強(qiáng)，超過了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來處理。圖2CT值和閾值顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基線，基線取決于實驗的質(zhì)量，CT值是一個完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA 的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。 正常的CT值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù) 的精度。4熒光信號和定量數(shù)據(jù)的歸一化雖然大多數(shù)定量 PCR儀

9、都會自動扣除本底，但是仍然需要 注意熒光信號強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實驗數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、 熒光激發(fā)效 率的差異等偶然誤差不可避免， 因此儀器收集到的原始信號必須 進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對定量結(jié)果的影響。 這種校正 可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度 是固定的，因此其信號的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激 發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對照基因的信號除以陽性參比信號以 后，即Rn = R / RROX，就可以在同樣的起點上進(jìn)行比較和各種 計算

10、。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性， 減少孔間差異（圖3）圖3 ROX熒光校正（左）和不校正（右）對實驗數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號再扣除本底，就得到 DRn: DRn = Rn,樣 本-Rn,空白。DRn是最后構(gòu)建PCR實時擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。無論絕對定量還是相對定量，在得到實驗結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。 在實驗操作中，取樣都是以體積或重量 為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目并不一 樣，所以拷貝/卩L或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實際上并不可 比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝 /細(xì)胞或拷貝/基因組為單位 后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋?/p>

11、完成。參比一般 選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細(xì)胞中的 表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小， 其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法 為：DNA樣本/ DNAIPC，或者 DCT = CT,樣本-CT, IPC。因 為CT值與起始DNA拷貝數(shù)的對數(shù)是反比關(guān)系， 可以證明，這兩 種計算方法在數(shù)學(xué)上是等價的。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時進(jìn)行定量測定，所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(In ternalPositive Control，IPC)。要進(jìn)行IPC歸一化校正，定量 PCR儀必 須具備多色檢測能力，最

12、好是 4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因 只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。5污染的預(yù)防和熱啟動為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和熱啟動。UNG 酶的作用原理是降解含有 dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50 ° C激 活，95° C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP， 所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開始前增加50 ° C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞， 防止可能造成的污染。普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取

13、措 施，在加入PCR試劑的過程中、正式 PCR開始前就會完成少量 PCR擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金牌Taq酶經(jīng)過特殊 修飾，常溫下其活性部位被圭封閉， 沒有活性；只有經(jīng)過95 ° C 10min的熱啟動以后，圭寸閉被解除，才能開始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實驗和陰性、陽性對照定量實驗，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實驗，對數(shù)據(jù)進(jìn)行 統(tǒng)計處理，可以將誤差降低到最小。 所以定量實驗的每個樣本至 少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù) 68次，以滿足小 樣本統(tǒng)計的要求。如果作絕對定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個點以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的

14、DNA樣本，可以自己制備，也可以購買商品化的試 劑盒。其PCR反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反 應(yīng)板上同時定量。陰性對照中不加模板DNA,而以水或緩沖液代替，用于檢 驗是否存在PCR污染。陽性對照則用于檢驗PCR試劑和實驗操 作上可能出現(xiàn)的問題。如果實驗中設(shè)立了 IPC,則IPC既可以用 來校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽性對照的作用。7 TaqMan探針技術(shù)原理TaqMan探針法是高度特異的定量 PCR技術(shù)，其核心是利用 Taq酶的35 '外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。由于探針與模板是特異性結(jié)合， 所以熒光信號的 強(qiáng)弱就代表了模 板的數(shù)量。在TaqMan探針法的定量PCR反

15、應(yīng)體系中，包括一對 PCR 引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合， 其結(jié)合位點在兩 條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter, R)，女口 FAM、VIC等，3 '端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q)，女口 TAMRA等。當(dāng)探針完整的時候，報告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被 淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在 鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35 '外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸 收，即產(chǎn)生熒光信號(圖 4)。所以，每經(jīng)過一個 PCR循環(huán)，熒 光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數(shù)增

16、長的過程。 信號的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。上游引物53s下游引物5'3!圖4 TaqMan探針的熒光信號產(chǎn)生機(jī)制TaqMan探針根據(jù)其3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的 TaqMan探針和TaqMan MGB探針。MGB探針的 淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán) (No n-Fluoresce nt Que ncher)，本 身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強(qiáng)度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團(tuán)(圖5)，可以將探針 的Tm值提高10 ° C左右。因此為了獲得同樣的 Tm值，MGB 探針可以比普通TaqMan探

17、針設(shè)計得更短，既降低了合成成本， 也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。實驗證明，TaqMan MGB探針對于富含 A/T的模板可以區(qū)分得更為理想報告基Minor Groove Binder滅基圖 5 TaqMan MGB 探針8 SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理 SYBR Green I是一種只 與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖 6）。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時， 發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因 此，在一個體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是

18、：1、開始反應(yīng)， 當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性 時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸 過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green 染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量 PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。圖6 SYBR Green I熒光染料與 DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的 DNA雙鏈相結(jié)合，對DNA模板沒有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒 光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對 PCR引物設(shè)計的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。 在此前提下，本法是一種成本低 廉的選

19、擇。9定量PCR儀簡介目前在國內(nèi)使用得比較多的熒光實時定量PCR儀有美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems , ABI)的 7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型為例作簡單介紹。7000型熒光定量PCR儀設(shè)計滿足臨床檢驗、醫(yī)學(xué)研究和基 礎(chǔ)實驗的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計軟件 Primer Express非常有用，因為到目前 為止還沒有其他軟件有能力設(shè)計定量PCR所需的TaqMan探針'7000型有實時動態(tài)(Real-Time)和終點讀板(Plate Re

20、ad)兩種運行模式。實時動態(tài)模式用于定量，測定DNA或RNA拷貝數(shù)。7000型可以動態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大 于7個數(shù)量級，區(qū)分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度 達(dá)99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷 酸多態(tài)性(SNP)分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通 PCR 儀使用。ABI已經(jīng)發(fā)布12萬個商品化的定量 PCR試劑盒，覆蓋 人類全部4萬個基因，平均每個基因 3個檢測試劑盒，為運用 7000、7700、7900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。7000型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為530590 nm，能夠有效地分辨 F

21、AMTM / SYBR? Green I、VICTM / JOETM、TAMRATM和ROXTM等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對照的 陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時對多 個目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。7000型支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBRGreen I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 Lie，丫. S. and C. J., Petropoulos. "Adva nces in qu

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