恒溫擴增技術(shù)綜述

1、【精品文檔】如有侵權(quán)，請聯(lián)系網(wǎng)站刪除，僅供學(xué)習(xí)與交流恒溫擴增技術(shù)綜述.精品文檔.摘要：恒溫擴增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后發(fā)展起來的一門新型的體外核酸擴增技術(shù)。目前主要的恒溫擴增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴增、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增、鏈替代擴增、依賴核酸序列擴增和解鏈酶擴增。它們都具有共同的特點：恒溫、高效、特異、不需要特殊的儀器設(shè)備。本文就現(xiàn)階段恒溫擴增技術(shù)的特點及其在動物疫病檢測中的應(yīng)用情況和前景做一綜述。關(guān)鍵詞：恒溫擴增；PCR引言：近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基于核酸檢測的診斷方法已大量建立并廣泛應(yīng)用于動物疾病的實驗室檢測中，恒溫擴增技術(shù)就是在此背景下出現(xiàn)的。與其它的核酸擴增技術(shù)相比，恒溫擴增有快速、

2、高效、特異的優(yōu)點且無需專用設(shè)備。所以它一經(jīng)出現(xiàn)就被許多學(xué)者認(rèn)為是一種有可能與PCR 媲美的檢測方法，目前主要的恒溫擴增技術(shù)有：滾環(huán)核酸擴增（rolling circle amolification，RCA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈替代擴增（strand displacement amplification，SDA）、依賴核酸序列擴增（nucleicacid sequence based amplification，NASBA） 和解鏈酶擴增（helix dependent amplification，HAD）

3、，這些技術(shù)各有特點，這也決定了它們在動物疾病檢測中的應(yīng)用情況，下面就它們的原理、特點及其在動物疫病檢測中的應(yīng)用情況進行綜述。1 滾環(huán)核酸擴增1. 1 滾環(huán)核酸擴增的原理滾環(huán)核酸擴增（rolling circleamolification, RCA）是通過借鑒病原生物體滾環(huán)復(fù)制DNA 的方式而提出的1，可分為線性擴增與指數(shù)擴增兩種形式。線性RCA 是引物結(jié)合到環(huán)狀DNA 上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列（與環(huán)狀DNA 完全互補）的線狀單鏈。線性RCA 用于靶核酸擴增僅限于一些具有環(huán)狀核酸的病毒、質(zhì)粒和環(huán)狀染色體，線性擴增倍數(shù)為105。指數(shù)RCA原理與線性RCA 相同，采

4、用與環(huán)狀DNA 序列完全一致的第二種引物，該引物與第一次線性RCA 產(chǎn)物結(jié)合并酶促延伸，其產(chǎn)物又作為第一種探針的模板，這樣一來在很短的時間內(nèi)（1h），產(chǎn)物呈指數(shù)遞增。指數(shù)RCA 可用于非環(huán)狀DNA 的擴增，增倍數(shù)能達107 2。1. 2 滾環(huán)核酸擴增的優(yōu)勢與不足RCA 的優(yōu)勢：(1) 高靈敏度。RCA有很強的擴增能力，線性RCA 的效率可達到l05 倍，而指數(shù)RCA 的效率可達到109 倍，這一高靈敏度特性使其能夠檢測到單拷貝水平3；(2)高序列特異性。可以區(qū)分單一位點的不同模式；(3) 擴增產(chǎn)物經(jīng)過磷酸化處理后可以直接用來測序。(4)高通量。RCA 可以在靶目標(biāo)上形成閉合的環(huán)狀序列，確保RC

5、A 產(chǎn)生的信號集中在一點，從而實現(xiàn)原位擴增和載片擴增； RCA 只要保證探針的識別段序列與靶序列互補，不需要考慮靶序列的性質(zhì)，因此檢測RNA 時不再需要預(yù)先進行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。RCA 的不足：（1）鎖式探針常接近100bp， 合成費用較高。2000 年，Antson DO 等采用PCR 方法在實驗室合成探針，可以在很大程度上降低成本；（2）信號檢測時的背景問題。在RCA 反應(yīng)過程中未成環(huán)的鎖式探針和未結(jié)合探針的模板DNA 或者RNA 可能產(chǎn)生一些背景信號。1. 3 滾環(huán)核酸擴增在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用雖然可以通過一些方法部分克服RCA 的不足，但也進一步增加了反應(yīng)成本，使得RCA 在動物疾病的臨床

6、檢測中不適合被采用。2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增2. 1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的原理環(huán)介導(dǎo)等溫擴增其擴增原理是基于DNA 在65左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA 的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈，在此前提下利用4 種不同的特異性引物識別靶基因的6 個特定區(qū)域，在鏈置換型DNA 聚合酶的作用下，以外側(cè)引物區(qū)段的3末端為起點，與模板DNA 互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成4。2. 2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的優(yōu)勢與不足LAMP 的優(yōu)勢：（1）擴增效率高，能夠在1h 內(nèi)有效的擴增1-10 個拷貝的目的基因，擴增效率為普通PCR的10 倍-100 倍；（2）反應(yīng)時間短，特異性強，不需要

7、特殊的設(shè)備。LAMP 的不足：（1） 對引物的要求特別高；（2） 擴增產(chǎn)物不能用于克隆測序，只能用于判斷；（3）由于其敏感性強，特別容易形成氣溶膠，造成假陽性影響檢測結(jié)果。2. 3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)在動物疾病檢測中的應(yīng)用LAMP 技術(shù)從誕生之日起就被認(rèn)為是最有可能代替PCR 進行實驗室檢測的方法。2008 年Anne-Lie B 等應(yīng)用RT-LAMP建立了豬水皰病病毒(SVDV)的診斷方法5，該方法對血清樣本的敏感性相當(dāng)于實時PCR，對糞便樣品的敏感性優(yōu)于實時PCR。3 鏈置換擴增3. 1 鏈置換擴增的原理鏈置換擴增其原理是基于在靶DNA 兩端帶有被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識別序列，核酸內(nèi)

8、切酶在其識別位點將鏈DNA 打開缺口，DNA 聚合酶延伸缺口3端并替換下一條DNA 鏈6。被替換下來的DNA 單鏈可與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)進行，使靶序列被高效擴增。SDA 的基本系統(tǒng)包括一種限制性核酸內(nèi)切酶、一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶、兩對引物、dNTP 以及鈣、鎂離子和緩沖系統(tǒng)。3. 2 鏈置換擴增技術(shù)的優(yōu)勢與不足SDA 的優(yōu)點：（1） 擴增效率高，據(jù)Walker 等人的報道，采用SDA 擴增結(jié)核分枝桿菌總DNA 中的一段序列時，37反應(yīng)2 小時后，可將靶序列擴增106 倍7；（2）反應(yīng)時間短，特異性強，不需要特殊的設(shè)備。SDA 的不足：（1）SDA 產(chǎn)

9、物不均一。在SDA 循環(huán)中總要產(chǎn)生一些單、雙鏈產(chǎn)物，用電泳法檢測時必然要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。（2）SDA 產(chǎn)物不可能直接用于克隆，測序和表達。使得SDA 在基因工程方面沒有優(yōu)勢；（3）SDA 產(chǎn)物的檢測手段有待提高。目前SDA 產(chǎn)物檢測的主導(dǎo)方法是熒光偏振檢測，但該檢測方法需要特殊的檢測儀器- 熒光分光光度計，這限制了SDA 在臨床的廣泛應(yīng)用。3. 2 鏈置換擴增在動物疫病檢測中的應(yīng)用當(dāng)前SDA 方法主要應(yīng)用于分枝桿菌核酸定性檢測、病毒體外進化研究23和芯片雜交等方面，還沒有運用于動物疫病的檢測。4 依賴核酸序列擴增4. 1 依賴核酸序列擴增的原理依賴核酸序列擴增(NASBA)是在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展

10、起來的一種新技術(shù)。是由1 對帶有T7 啟動子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫、基于酶反應(yīng)的核酸擴增技術(shù)，反應(yīng)在41進行，可在2 h 內(nèi)將模板RNA 擴增109 倍8，比常規(guī)PCR 法高1000 倍。4. 2 依賴核酸序列擴增的優(yōu)勢與不足NASBA 技術(shù)的優(yōu)勢在于對RNA 病毒的檢測，因為：（1）它的引物上帶有T7 啟動子序列，而外來雙鏈DNA 無T7 啟動子序列，不可能被擴增，因此在有DNA 污染的條件下，NASBA 技術(shù)同樣具有較高的特異性和靈敏度9；（2）NASBA 將反轉(zhuǎn)錄過程直接合并到擴增反應(yīng)中，縮短了反應(yīng)時間。NASBA 也存在許多缺陷：（1）反應(yīng)成分比較復(fù)雜；（2） 需要3 種酶使得反應(yīng)

11、成本較高；（3）對DNA 病毒的檢測上NASBA 就顯得不是那么適合。4. 3 依賴核酸序列擴增在動物疫病檢測中的應(yīng)用NASBA 與LAMP 一樣在恒溫擴增技術(shù)中是相對成熟技術(shù)，現(xiàn)在已應(yīng)用于動物疫病檢測中。我國2004 年發(fā)布的8 項禽流感系列標(biāo)準(zhǔn)中，有兩項應(yīng)用了NASBA檢測方法， 即GBT19439-2004H5 亞型禽流感病毒NASBA 檢測方法和GBTl9440-2004禽流感病毒NASBA 檢測方法10。6 小結(jié)動物疫病的檢測是一項特殊的檢測工作，它一方面需要快速、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，另一方面對檢測的成本也有著苛刻的要求。而恒溫擴增技術(shù)在很大程度上符合了它的需要，雖然說當(dāng)前把恒溫擴增技術(shù)

12、運用于動物疫病的檢測還有著不少的缺陷，但它的優(yōu)越性也是有目共睹的，特別是其中的LAMP 和NASBA 已經(jīng)逐漸開始運用到動物疫病的檢測中。我們相信通過對恒溫擴增技術(shù)的不斷完善，它必然會和PCR 技術(shù)一樣成為動物疫病檢測中不可缺少的檢測手段?！緟⒖嘉墨I】 1 Hobbie J E，Daley R J, and JasperS. Use of nuclepore filters for countingbacteria by fluorescence microscopyJ.Appl Envir Microbiol，1977，33 (5)：1225-12282 李影，王偉利，錢愛東. 畜產(chǎn)中相關(guān)食

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