藥品微生物檢驗特點及過程控制VIP

1、.中國藥品生物制品檢定所中國藥品生物制品檢定所2010年年5月月26日日 上海上海web site: e-mail: tel: 地址：北京市天壇西里地址：北京市天壇西里2 2號號 郵編：郵編：100050100050 .2 2l藥品因素l環(huán)境影響l培養(yǎng)觀察l抽樣檢查l破壞試驗方法驗證過程控制.3 3無菌無菌/ /微生物限度檢查理念微生物限度檢查理念環(huán)境保證環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查無菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查有效的方法有效的方法方法驗證方法驗證SOP操作操作有效的結果有效的結果可靠的結論可靠的結論結果判斷結果判斷.4 4微生物檢查的過程控制微生物檢查的過程控制l一、實驗設施（硬件

2、物質(zhì)保障）l二、檢驗程序（軟件有效的結果）l三、結果判斷（調(diào)查可靠的結論）.5 5一、實驗設施l實驗室系統(tǒng)l操作環(huán)境l關鍵設備l對照培養(yǎng)基物 質(zhì) 保 障.6 6（一）、實驗室系統(tǒng)（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件潔凈實驗條件l有效性：有效性：整體10000級、局部100級。l安全性：安全性：保護樣品、人員和環(huán)境。l可操作性：可操作性：方便、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護、驗證潔凈實驗條件的維護、驗證陽性菌實驗室達到陽性菌實驗室達到P2P2生物安全標準生物安全標準.7 7實驗室改造示例：原布局圖 擬定布局圖 建議布局圖1 建議布局圖2實驗室系統(tǒng)中檢所微生物實驗室.8 8（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的

3、管理與維護：1、屏障系統(tǒng)的有效性 壓差、風速、微粒、照度 （外包服務合同）2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物.9 9環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：l頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）l溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）l緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）l科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）l藤黃微球菌（Micrococcusluteus）.1010（二）、操作環(huán)境l1、隔離器l2、生物安全柜l3、超凈工作臺.1111（二）、操作環(huán)境分類樣品安全人員

4、安全環(huán)境要求點評隔離器？驗證困難，滅菌不徹底：假陽性 滅菌劑殘留：假陰性生物安全柜？動態(tài)驗證困難，不適合多任務的檢驗活動超凈工作臺經(jīng)典、廉價、適合多任務的檢驗活動。提高實驗室新風供給、加強實驗室監(jiān)控可以揚長避短.1212搽拭實驗菌株菌液計數(shù)回收計數(shù)回收率大腸埃希菌191894.7%金黃色葡萄球菌646093.8%菌液稀釋、分液的誤差為：5.5%表面搽拭操作的回收率大于 99%.1313（三）、關鍵設備 微生物檢查薄膜過濾儀微生物檢查薄膜過濾儀 一次性薄膜過濾培養(yǎng)器一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器.1414（四）、對照培養(yǎng)基 培養(yǎng)基適用性（靈敏度）

5、； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標準化）。對照培養(yǎng)基理化評價（可控性）生物學評價（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法.1515二、檢驗程序環(huán)境保證環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查無菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查有效的方法有效的方法方法驗證方法驗證SOP操作操作有效的結果有效的結果可靠的結論可靠的結論結果判斷結果判斷.1616二、檢驗程序l接受任務l實驗方案l實驗準備l樣品核對l實驗操作l過程監(jiān)控l培養(yǎng)觀察有效的結果物 質(zhì) 保 障.1717實驗室管理規(guī)范（軟件）實驗室管理規(guī)范（軟件）中檢所抗生素室微生物實驗室質(zhì)量管理體系中檢所抗生素室微生物實驗

6、室質(zhì)量管理體系l編寫說明及批準頁l1 實驗室概況l1.1 實驗室簡介 l1.2 實驗室通訊資料 l1.3 實驗室認可項目/參數(shù)表l1.4 實驗室平面圖及功能區(qū)域 l1.5 儀器設備總覽l1.6 常備試劑耗材一覽表l1.7 實驗室發(fā)展目標l2 管理規(guī)范l2.1 安全管理l2.2 業(yè)務流程l2.3 人員管理（6個SOP）l2.4 樣品管理（3個SOP）l3 標準操作規(guī)程l3.1 檢驗工作SOP（13個）l3.2 儀器操作SOP（30個）l3.3 實驗記錄SOP（9個）l4 實驗室保障l4.1 實驗室設施、設備及消耗品供應商確定原則l4.2 實驗室設施服務商l4.3 實驗設備供應商l4.4 實驗室消

7、耗品供應商.1818（一）、實驗準備l實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質(zhì)準備有備無患，應隨時保證“來之能戰(zhàn)” 。l尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。.1919實驗準備無菌室專用酒精棉球制備實驗準備場地清潔實驗準備臺面清潔.2020（二）、樣品核對l盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程中的完整性、安全性、有效性；l仔細核對樣品及樣品資料，高度關注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析；l樣品外觀檢查、完整性檢查。.2121樣品外觀檢查欣弗樣品外觀檢查刺五加樣品外觀檢查雙黃連樣品完整性真空檢漏.2222（三）、實驗操作l不斷完善

8、標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實驗室污染。實驗人員實驗人員 培養(yǎng)基培養(yǎng)基實驗器材實驗器材實驗環(huán)境實驗環(huán)境檢驗結果檢驗結果待檢樣品待檢樣品原料原料 輔料輔料 設備設備環(huán)境環(huán)境藥品（食品）藥品（食品）人員人員 藥品食品生產(chǎn)過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié).2323實驗操作物料進場消毒液搽拭物品外表面潔凈傳遞（風淋、紫外照射）雙層無菌包裝核心區(qū)外圍實驗操作人員進場一更二更核心操作區(qū)實驗操作無菌操作技術.2424（四）、實驗過程監(jiān)控樣品監(jiān)控手指監(jiān)控沉降菌監(jiān)控無菌檢驗框架示意圖無菌檢驗框架示意圖.2525三、結果判斷l(xiāng)長菌與否l分離鑒定l溯源調(diào)查l結果報

9、告可靠的結論有效的結果物 質(zhì) 保 障.2626三、結果判斷 是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物來自哪里？ 幾點思考 參見：FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)境菌的相似性考 察藥學學報，2007，42（11）：11891194 判斷無菌檢查陽性結果有效性的實驗探討藥物分析雜志， 2008， 28（05）：6671 .27271、長菌與否？l渾不渾濁?l物理變化、化學變化還是生物變化？一靠經(jīng)驗二靠實驗三靠嚴格程序控制避免干擾.2828是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學變化？生物學變化？（2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？.292

10、9菌落or藥渣？l經(jīng)經(jīng)6060CoCo射線大劑量照射再檢驗射線大劑量照射再檢驗l延長培養(yǎng)時間到延長培養(yǎng)時間到7 7天天l重新劃線培養(yǎng)重新劃線培養(yǎng)l鏡檢鏡檢.30302、分離鑒定l（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；l（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80保存；l（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；l（4）如果發(fā)現(xiàn)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。.3131是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、D

11、NA） .32323、溯源調(diào)查l樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株l檢驗過程監(jiān)控菌株l環(huán)境菌（近期、遠期）l現(xiàn)場調(diào)查收集菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)方法與新技術相結合不同方法的交叉驗證.3333微生物來自哪里？ 相似性分析 同源性分析 脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR） .3434Sample Preparation Automated measurement after drying of the samples!2. Suspending1. Harvesting3. LoadingFT-IR Spektrum of microorganisms圖圖 不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關系

12、不同來源的陰溝腸桿菌紅外圖譜聚類關系.3535The Infrared Spectrumlipidsproteinscarbohydratessaltswatercell wallcapsulesDNA, RNAflagellates, piliribosomevacuoles .FT-IR spectrum is a fingerprint of the cellsBiochemical Structure of Cells.3636.3737溯源性分析例溯源性分析例11欣弗事件欣弗事件 圖圖29 欣弗培養(yǎng)物欣弗培養(yǎng)物圖30 欣弗培養(yǎng)物分離菌株鏡檢.3838編號濾筒中形態(tài)革蘭染色BD鑒定02

13、06L渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）0206G渾濁，劇烈產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）0112G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）0104L顆粒狀懸浮物，振搖能散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）298L；298G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌

14、1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）303L；303G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）305L；305G渾濁，產(chǎn)氣1、G-球桿菌2、G-短桿菌1、肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）；2、粘質(zhì)沙雷菌（Serratia marcescens）306L；306G

15、渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）307G渾濁，產(chǎn)氣G-球桿菌肺炎克雷伯肺炎亞種（Klebsiella pneumoniae ssp pneumoniae）308L渾濁（Alcaligenes faecalis）308G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）309L渾濁（Alcaligenes faecalis）309G致密片狀、絮狀物，振搖不散G+長鏈桿菌（液體培養(yǎng)物直接涂片）304G渾濁G-桿菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）.3939溯源性分析

16、例溯源性分析例11欣弗事件欣弗事件 頭狀葡萄球菌頭狀亞種頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcuscapitissspcapitis）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亞種科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcuscohniisspcohnii）藤黃微球菌藤黃微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株監(jiān)測到的環(huán)境菌株.4040溯源性分析例溯源性分析例2 2編號

17、BD鑒定鑒定走廊1B.pumilus 走廊2M.luteus 走廊3/無菌室4C.urealyticum 無菌室5K.kristinae 無菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidis C15

18、26-F2S.haemolyticus菌株16sRNA鑒定鑒定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 雙黃連注射液雙黃連注射液 利巴韋林注射液利巴韋林注射液 FTIR FTIR相似性分析相似性分析 DuPont RiboPrinter DuPont RiboPrinter基因指紋分析基因指紋分析.4141幾點思考（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認識微生物本身 微生物變異與保守的相對性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學先鋒琳恩馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個特殊的質(zhì)粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。 .4242幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？ 需要深入認識分析微生物的技術和手段 形態(tài)學分析與相似性分析（生化反應譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），